Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre os mecanismos e energéticos do transporte de proteínas através de membranas cloroplastas, bem como a localização de proteínas dentro de plastídeos. A principal vantagem desta técnica para a segmentação da proteína thylakoid é que ela permite o controle completo do ambiente da timoide durante o transporte, incluindo temperatura, pH, condições iônicas e concentrações precursoras. Comece absorvendo aproximadamente 55 gramas de ervilhas em 400 mililitros de água destilada por três horas.
Semear as ervilhas encharcadas em uma bandeja de plástico no solo, coberta com uma fina camada de vermiculite, e crescer por nove a 15 dias, como descrito no protocolo de texto. No dia do isolamento do cloroplasto, prepare um gradiente de densidade contínua centrifugando uma mistura de 15 mililitros de Percoll e 15 mililitros de tampão de 2xGB em um tubo de centrífuga de alta velocidade de 15 mililitros a 30,900 gs em um rotor de ângulo fixo por 30 minutos a quatro graus Celsius com o freio desligado. Em seguida, colher aproximadamente 25 gramas de nove a 15 dias de pea shoots.
Adicione-os a 95 mililitros de tampão frio de 1xGB em um liquidificador refrigerado, com lâminas afiadas. E homogeneizar. Filtre essa mistura através de um mínimo de duas camadas de pano de queijo, colocado em um funil sobre um béquer resfriado.
Centrifugar o filtrado usando um tubo de centrífuga de 15 mililitros de policarbonato em um rotor de balde balançando a 3.000 gs por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e use um pincel para resuspensar suavemente a pelota em um mililitro de 1xGB. Depois disso, use uma pipeta de postura de vidro para cuidadosamente camada a suspensão da tela em cima do gradiente Percoll.
Centrifuá-lo em um rotor de balde balançando a 8.000 gs por 10 minutos a quatro graus Celsius com o freio desligado. Usando uma pipeta de postura novamente transfira cuidadosamente a faixa verde inferior contendo cloroplastos intactos em um tubo de policarbonato fresco de 50 mililitros e adicione 30 mililitros de tampão 1xIB. Centrifugar o tubo em um rotor de balde balançando a 1.800 gs por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Depois de descartar o supernascimento, resuspenque suavemente a pelota em um mililitro de 1xIB com um pincel. Lave em 30 mililitros de 1xIB e centrífuga novamente sob as mesmas condições. Resuspend a pelota após a centrifugação final em um mililitro de 1xIB.
Para determinar a concentração de clorofila, misture 10 microliters de cloroplastos totalmente resuspended com cinco mililitros de 80% de acetona. Filtre através de um papel filtro de 180 micrômetros de espessura com tamanho de 11 micrômetros e, em seguida, determine a concentração de clorofila por espectrofotômetro. Diluir a mistura de cloroplasto a um miligrama por mililitro usando 1xIB frio.
Para começar a isolar as tireilaliteides quando o extrato estrommal não é necessário, como o transporte cpTat, cloretos intactos centrífugas em tubos de 1,5 mililitro em um rotor de balde balançando a 1.000 gs a quatro graus Celsius por seis minutos. Depois disso, descarte o supernascer e resuspenque a pelota no tampão de lise hipotônica para alcançar um miligrama por mililitro com uma micropipette. Incubar no gelo no escuro com mistura ocasional por 10 minutos.
Para recuperar as timocóidas, centrífuga em um rotor de balde balançando a 3.200 gs a quatro graus Celsius por oito minutos. Lave as timocóidas duas vezes, reutilizando a pelota com um a dois mililitros de tampão de lise e, em seguida, centrifugando sob as mesmas condições. Após a centrifugação final, resuspenque a pelota, em um mililitro de tampão 1xIB e determine a concentração de clorofila em tirolokoides isolados usando um espectrofotômetro como demonstrado anteriormente.
Para caminhos que requerem recuperação de extratos estrômicos, como CPSec1 e CPSRP eliquate 600 microliters de cloroplastos isolados em um rotor de balde balançando e centrífuga a 1.000 gs por seis minutos a quatro graus Celsius. Para a lise cloroplasta, suspendemos a pelota com 600 microliters de tampão de hipotônica de lise. Incubar no gelo no escuro por 10 minutos com mistura ocasional.
Em seguida, centrifugar os tubos em um rotor de balde balançando a 3.200 gs por oito minutos a quatro graus Celsius. Para salvar o estroma, transfira o verde claro para o supernatante amarelo para um novo tubo de micro centrífuga e adicione um volume igual de 2x de tampão estrommal bruto. Para lavar as timocóidas, adicione dois volumes de tampão de lise e centrífuga a 3.200 gs por oito minutos a quatro graus Celsius.
Resuspend a pelota em 1xIB para obter concentração de clorofila de um miligrama por mililitro e reserve no gelo para uso posterior em ensaios de transporte. Remova as membranas residuais do estroma bruto centrifugando o estroma bruto diluído em um rotor de ângulo fixo a 42.000 gs por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, colecione 95% do volume de cada tubo certificando-se de não perturbar a pequena pelota verde amarela, observando o volume retirado de cada tubo.
Para preparar o extrato estrommal concentrado, reconte as supernantes coletadas. Em seguida, use um concentrador de corte de peso molecular de 4 mililitros de 30 kilodalton para concentrar o extrato cinco vezes. Para avaliar o transporte cpTat em um tubo de 1,5 mililitro no gelo misture as thylokoids isoladas a uma concentração final de clorofila de 0,33 miligramas por mililitro, cinco MILimil ATP preparado em 1xIB e oito milimilas DTT preparados em 1xIB.
Para iniciar o transporte, introduza a proteína do substrato à mistura de transporte. Conduza a reação iluminando a suspensão com 80 a 100 microeínsteins por metro quadrado por segundo de radiação fotossintética ativa por 10 minutos à temperatura ambiente. Para parar a reação de transporte, diluir a suspensão oito vezes com gelo frio 1xIB.
Centrífuga a 3.200 gs em uma micro centrífuga por cinco minutos a quatro graus Celsius para recuperar timokoides. Depois de descartar o supernascer, resuspenque a pelota em 120 microliters de gelo frio 1xIB. Para avaliar as vias CPSec1 ou PSRP, misture as seguintes em um tubo de 1,5 mililitro no gelo.
Thylakoids para uma concentração final de clorofila de 0,33 miligramas por mililitro, 0,83 miligramas por mililitro equivalentes de clorofila de extrato estrommal, e cinco MILimola ATP preparado em 1xIB. Leve a reação até o volume desejado com gelo frio 1xIB e incubar no gelo por 10 minutos. Para iniciar o transporte introduza 10% de volume por volume de proteína de substrato a esta mistura de transporte.
Ilumine com 80 a 100 microeínsteinos por metro quadrado por segundo de radiação fotossintética ativa por 10 minutos à temperatura ambiente. Para parar a reação, diluir a suspensão oito vezes com gelo frio 1xIB. Centrífuga a 3.200gs em uma micro centrífuga por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Depois de descartar o supernascer, resuspenque a pelota em 120 microliters de gelo frio 1xIB. Para remover o substrato residual que não foi transportado, digerir proteína externa adicionando seis microlitadores de dois miligramas por termolysina mililitro e cloreto de cálcio de 10 mililitros em 1xIB. Incubar esta reação protease no gelo por 40 minutos.
Sacie a protease dobrando o volume com 25 mililitros EDTA em 1xIB. Centrífuga a 3.200 gs em uma micro centrífuga por cinco minutos a quatro graus Celsius para recuperar timokoides. Depois de remover o supernascer, resuspend recuperou thylokoids em 120 microliters de cinco milimolar EDTA em 1xIB, e transferir para um novo tubo de 1,5 mililitro.
Depois de centrifugar novamente a 3.200 gs em uma micro centrífuga por cinco minutos a quatro graus Celsius, descarte o supernascer e resuspenda a pelota em um volume apropriado de tampão de laemmli, complementado com 10 mililitros EDTA. Coloque as amostras em um banho de água fervente por 10 minutos. Prossiga para analisar as amostras pela página da SDS.
O transporte da proteína iOE17 através da via cpTat resultou em uma mudança de tamanho de dois a três kilodaltons entre o substrato introduzido e a forma processada madura. Isso se deve ao decote do peptídeo de sinal n terminal indicando um transporte cpTat bem sucedido. O tratamento da termolise deixa apenas a banda madura transportada com sucesso e, portanto, resistente ao proteus.
O transporte do precursor OE33 através da via CPSec1 resultou em uma mudança de tamanho no substrato maduro, e proteção proteus do substrato transportado. A inserção do precursor LHCP na membrana thylokoide através da via cpSRP, avaliada através da digestão termolysina levou a uma mudança de tamanho de 1,5 para dois kilodaltons. Isso indicou inserção de membrana bem sucedida, pois a membrana protege o produto de degradação LHCP maduro da proteólise completa.
Depois de assistir a este vídeo você deve ter uma boa compreensão de como isolar thylokoids e avaliar a vias de cpTat, cpSec 1 e cpSRP. Uma vez dominada esta técnica pode ser feita em três a quatro horas quando realizada corretamente. Embora não ilustrado neste vídeo, geralmente mantemos as luzes aéreas apagadas no laboratório ao isolar e trabalhar com cloroplastos e tireoides fotosinteticamente ativos.
Ao tentar este procedimento é importante manter cloroplasto isolado e tireoides a quatro graus Celsius. Lembre-se de resuspend cloroplastos suavemente no início. Evite perturbar o gradiente Procoll após a primeira etapa de centrífuga.
Além disso, a amostra de entrada percentual pode ser preparada em paralelo com as reações de transporte e executada no mesmo gel para estimar o transporte do substrato. Não se esqueça que trabalhar com substratos radioativos requer manuseio consciente e EPI adequado. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da proteica para explorar a energia, cinética e mecanismos únicos que regem o transporte de proteínas através de membranas de tirokoóide.
