تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية هو أداة قوية لدراسة ملفات تعريف النسخ للخلايا، وخاصة في الأنسجة غير المتجانسة، مثل الجهاز العصبي المركزي. يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل النوى لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة. باستخدام النوى بدلا من الخلايا، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الأنسجة التي يصعب تفكيكها، وكذلك الأنسجة المجمدة.
وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة نوع الخلية التغييرات الخاصة في الخلايا التالية للمرض أو الإصابة. ابدأ هذا الإجراء بالقتل الرحيم للماوس، كما هو موضح في بروتوكول النص. المقبل، وجعل شق على طول الجسم لفضح الأجهزة الداخلية.
Eviscerate الماوس عن طريق سحب الأعضاء الداخلية من تجويف الجسم باستخدام ملقط. لا تستخدم مناشف ورقية لتنظيف المنطقة أو لإزالة الأعضاء ، لأن هذا قد يؤدي إلى إدخال الملوثات. باستخدام المقص، قطع العمود الفقري بين الفقرات الشوكية L2 و L3.
لإخراج الحبل الشوكي، تناسب حقنة ثلاثة ملليلتر تحتوي على PBS الجليد الباردة مع إبرة قياس 25 1/4 بوصة. ضع طرف الإبرة في النهاية الكاسية للعمود الفقري. استخدام إصبعين لقرص فقرات لخلق ختم ضيق حول غيض من الإبرة، واضغط على المكبس إلى أسفل لإخراج الحبل الشوكي rostrally.
ضع الحبل الشوكي في طبق بيتري مع PBS بارد. إذا كان هناك حاجة فقط إلى الجزء القطني من الحبل، تقليم بعيدا الأجزاء الصدرية والصدرية من الحبل الشوكي. عند هذه النقطة ، وتجميد الأنسجة وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية ، أو استخدامها على الفور إما لتحلل الخلايا الميكانيكية المنظفات كما هو موضح هنا ، أو التحلل الميكانيكية الهابوتونية كما هو موضح في بروتوكول النص.
لتحديد تحلل الخلايا الميكانيكية المنظفات، ضع الحبل الشوكي القطني في هجنة Dounce المبردة مسبقًا وأضف 500 ميكرولترات من عازل المنظفات المبردة مسبقًا. Dounce مع خمس ضربات من الآفة فضفاضة ، A ، ثم خمس إلى 10 السكتات الدماغية من الآفات الضيقة ، B.Avoid رفع المهيجين خارج حل التحلل بين السكتات الدماغية ، وتجنب إدخال الفقاعات. الآن، ضع مصفاة 40 ميكرون على أنبوب مخروطي 50 ملليلتر مبرد مسبقًا ومبلل مسبقًا مع ملليلتر واحد من عازل السكروز المنخفض.
إضافة ملليلتر واحد من العازلة السكروز منخفضة إلى التجانس Dounce التي تحتوي على النوى الخام في العازلة تحلل، واخلط بلطف عن طريق الأنابيب مرتين إلى ثلاث مرات. تمرير الإعدادية نوى الخام على مصفاة 40 ميكرون, في ما قبل المبردة 50 ملليلتر أنبوب مخروطي. تمرير إضافية ميليلتر منخفضة السكروز العازلة على 40 ميكرون مصفاة، وبذلك حجم النهائي إلى ثلاثة ملليلتر من العازلة السكروز منخفضة و 500 ميكرولترات من العازلة تحلل.
كرر هذه الخطوات إذا الجمع بين أسلاك متعددة، والتبريد في نفس أنبوب مخروطي. ثم، الطرد المركزي العينة في 3200 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. بمجرد اكتمال الطرد المركزي، يندد بالناذر.
نعلق لوحة باستخدام ثلاثة ملليلتر من انخفاض sucrose العازلة. دوامة بلطف لإزالة بيليه من الجدار لتسهيل resuspension. بعد السماح للعينة الجلوس على الجليد لمدة دقيقتين، ونقل التعليق إلى أنبوب أوك ريدج.
باستخدام التجانس في وضع واحد، التجانس النوية في العازلة السكروز منخفضة لمدة 15 إلى 30 ثانية، والحفاظ على العينة على الجليد. ثم، استخدام ماصة المصلية لطبقة 12.5 ملليلتر من العازلة السكروز كثافة، تحت التجانس العازلة السكروز منخفضة، مع الحرص على عدم خلق فقاعة أن يعطل طبقات الكثافة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 3200 مرات G، لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية.
مرة واحدة في الطرد المركزي كاملة، على الفور ديسانت عظمى في حركة الخفقان. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر لإزالة أنبوب أوك ريدج فورا من جهاز الطرد المركزي، وبسرعة طاردة فائقة. باستخدام 100 ميكرولترتر إلى ملليلتر واحد من محلول إعادة النيوسينجيون، نعلق النوى المتبقية على الجدار.
تجنب عبوس الميلين الذي يبقى مع إعداد القائم على المنظفات. يمكن أن يؤدي الفشل في القيام بهذه الخطوات بسرعة إلى إعداد نوات مع الحطام الخلوي الزائد ، أو الميلين ، والتي يمكن أن تعوق تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في المصب. تصفية النوى من خلال 30 إلى 35 ميكرون المسام حجم مصفاة وجمع في أنبوب ما قبل المبردة.
تحديد العائد النووي، باستخدام مقياس الهيموسيتات لحساب النوى تحت هدف 10 x، قبل الشروع في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة، كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر صور الحقل الساطع و epifluorescent من النوى ، المعزولة باستخدام بروتوكول التحلل الميكانيكي للمنظفات ، في 10 x. هذه النوى معزولة بطريقة غير متحيزة، مما يسمح لدراسة ملامح التعبير الجينية الذاتية على مستوى خلية واحدة.
يظهر هنا، هو مؤامرة تمثيلية tSNE من تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة، من الحبل الشوكي القطني الماوس، وذلك باستخدام منصة تغليف قطرات موازية على نطاق واسع. يمكن استخدام النوى المعزولة من الأنسجة الطازجة أو المجمدة في التسلسل على كل من المنصات التجارية والأكاديمية. هذه التقنية تمكن الباحثين من استكشاف ملامح النسخ على مستوى الخلية الواحدة، وذلك باستخدام الأنسجة التي يصعب تفكيكها، مثل الحبل الشوكي، أو حتى الأنسجة المجمدة، مثل المواد البنك الحيوي.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تقليل مقدار الوقت بين القتل الرحيم والتحلل الخلوي. وعلاوة على ذلك، من المهم تقليل الفقاعات التي أدخلت في الحلول من التحلل الخلوي إلى إعادة الدمج، وشراء نواة الحيوانات الأليفة بعناية. وبعد هذا الإجراء، يمكن استخدام النوى في تطبيقات بديلة، مثل فرز الفاكسات، من أجل عزل أنواع خلايا محددة.
