O sequenciamento de RNA unicelular é uma ferramenta poderosa para estudar perfis transcricionais de células, particularmente em tecido heterogêneo, como o sistema nervoso central. Este protocolo fornece um método para isolar núcleos para sequenciamento de RNA de núcleo único. Usando núcleos em vez de células, este método pode ser aplicado a tecidos difíceis de dissociar, bem como tecido congelado.
Além disso, este método pode ser aplicado para estudar alterações específicas do tipo celular nas células após doença ou lesão. Inicie este procedimento com eutanásia de rato, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, faça uma incisão ao longo do comprimento do corpo para expor os órgãos internos.
Eviscerar o rato puxando os órgãos internos da cavidade corporal usando fórceps. Não use toalhas de papel para limpar a área ou para remover órgãos, pois isso pode introduzir contaminantes. Usando uma tesoura, corte a coluna vertebral entre as vértebras espinhal L2 e L3.
Para ejetar a medula espinhal, coloque uma seringa de três mililitros contendo PBS gelado com uma agulha de 25 metros de calibre 1/4 polegada. Coloque a ponta da agulha na extremidade sacral da coluna vertebral. Use dois dedos para beliscar as vértebras para criar uma vedação apertada ao redor da ponta da agulha, e pressione para baixo no êmbolo para ejetar a medula espinhal rostrally.
Coloque a medula espinhal em uma placa de Petri com PBS gelado. Se for necessária apenas a porção lombar do cordão, corte as porções sacral e torácica da medula espinhal. Neste ponto, congele o tecido e armazene a menos 80 graus Celsius, ou use imediatamente para lise celular mecânica detergente como descrito aqui, ou lise mecanicamente hipotônica, conforme descrito no protocolo de texto.
Para determinar a lise celular mecânica detergente, coloque a medula espinhal lombar em um homogeneizador Dounce pré-refrigerado e adicione 500 microliters de tampão de detergente pré-refrigerado. Dounce com cinco golpes do pilão solto, A, e depois cinco a 10 golpes do pilão apertado, B.Evite levantar o homogeneizador fora da solução de lise entre os traços, e evite introduzir bolhas. Agora, coloque um coador de 40 mícrons sobre um tubo cônico pré-refrigerado de 50 mililitros e pré-molhado com um mililitro de baixo tampão de sacarose.
Adicione um mililitro de tampão de sacarose baixa ao homogeneizador Dounce contendo os núcleos brutos no tampão de lise e misture suavemente por pipetar duas a três vezes. Passe os núcleos brutos de preparação sobre o coador de 40 mícrons, para o tubo cônico pré-refrigerado de 50 mililitros. Passe um amortecedor de sacarose de um mililitro adicional sobre o filtro de 40 mícrons, trazendo o volume final para três mililitros do tampão de sacarose baixa e 500 microliters do tampão de lise.
Repita estas etapas se combinar vários cabos, resfriando no mesmo tubo cônico. Em seguida, centrifugar a amostra a 3200 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Uma vez que a centrifugação esteja completa, decante o supernatante.
Suspendemos a paleta usando três mililitros de baixo tampão de sacarose. Gire suavemente para remover a pelota da parede para facilitar a suspensão. Depois de deixar a amostra no gelo por dois minutos, transfira a suspensão para um tubo de Oak Ridge.
Utilizando o homogeneizador na configuração um, homogeneize os núcleos em baixo tampão de sacarose por 15 a 30 segundos, mantendo a amostra no gelo. Em seguida, use uma pipeta sorológica para a camada 12,5 mililitros de tampão de sacarose de densidade, sob o baixo tampão de sacarose homogeneizar, tomando cuidado para não criar uma bolha que interrompa as camadas de densidade. Centrifugar os tubos a 3200 vezes G, por 20 minutos a quatro graus Celsius.
Uma vez que a centrifugação esteja completa, decante imediatamente o supernatante em um movimento de movimento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de remover imediatamente o tubo de Oak Ridge da centrífuga, e rapidamente decantar o supernante. Usando 100 microlitres para um mililitro de solução de resuspensão, suspendemos os núcleos restantes na parede.
Evite a carranca de mielina que permanece com a preparação à base de detergente. A falha em fazer essas etapas rapidamente pode resultar em uma preparação de núcleos com detritos celulares em excesso, ou mielina, o que pode impedir o sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante. Filtre os núcleos através de um coador de tamanho de poros de 30 a 35 mícrons e colete em um tubo pré-refrigerado.
Determine o rendimento dos núcleos, utilizando um hemótmetro para contar núcleos sob um objetivo de 10 x, antes de prosseguir para o sequenciamento de RNA de núcleo único, conforme descrito no protocolo de texto. O campo brilhante e imagens epifluorescentes dos núcleos, isolados usando o protocolo de lise mecânica detergente, são mostrados a 10 x. Esses núcleos são isolados de forma imparcial, permitindo o estudo de perfis de expressão genética endógena ao nível de uma única célula.
Mostrado aqui, é um gráfico tSNE representativo de sequenciamento de RNA de núcleo único, de uma medula espinhal lombar de rato, usando uma plataforma de encapsulamento de gotículas massivamente paralela. Núcleos isolados de tecido fresco ou congelado podem ser usados para sequenciamento em plataformas comerciais e acadêmicas. Essa técnica permite que os pesquisadores explorem perfis transcricionais no nível unicelular, utilizando tecidos difíceis de dissociar, como a medula espinhal, ou mesmo tecido congelado, como material biobanco.
Ao tentar esse procedimento, é importante reduzir o tempo entre eutanásia e lise celular. Além disso, é importante minimizar as bolhas introduzidas em soluções desde a lise celular até a ressuspensão, e comprar núcleos de animais de estimação com cuidado. Após esse procedimento, os núcleos podem ser utilizados para aplicações alternativas, como a triagem de facs, a fim de isolar tipos de células específicas.
