Одноклеточное секвенирование РНК является мощным инструментом для изучения транскрипционных профилей клеток, особенно в неоднородных тканях, таких как центральная нервная система. Этот протокол предоставляет метод изоляции ядер для одноядерного секвенирования РНК. Используя ядра вместо клеток, этот метод может быть применен к трудно диссоциативным тканям, а также замороженным тканям.
Кроме того, этот метод может быть применен для изучения клеток типа конкретных изменений в клетках после болезни или травмы. Начните эту процедуру с эвтаназии мыши, как описано в текстовом протоколе. Затем сделайте разрез по длине тела, чтобы разоблачить внутренние органы.
Вывести мышь, вытащив внутренние органы из полости тела с помощью типсов. Не используйте бумажные полотенца для очистки области или для удаления органов, так как это может привести загрязняющих веществ. Используя ножницы, вырезать позвоночный столб между L2 и L3 позвонков позвоночника.
Чтобы извлечь спинной мозг, подходят три миллилитров шприц, содержащий ледяной PBS с 25 калибровочных 1 / 4 дюйма иглы. Поместите кончик иглы в сакральный конец позвоночного столба. Используйте два пальца, чтобы ущипнуть позвонки, чтобы создать плотный уплотнение вокруг кончика иглы, и нажмите вниз на поршень, чтобы извлечь спинной мозг rostrally.
Поместите спинной мозг в чашку Петри с ледяной PBS. Если требуется только поясничная часть шнура, обрежьте сакральные и грудные части спинного мозга. На данный момент, заморозить ткани и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию, или немедленно использовать либо моющее средство механического лиза клеток, как описано здесь, или гипотонический механическийлиз, как описано в текстовом протоколе.
Для определения моющего средства механического клеточного лиза поместите поясничный спинной мозг в предварительно охлажденный гомогенизатор Dounce и добавьте 500 микролитров предварительно охлажденного моющего средства лиза буфера. Dounce с пятью штрихами рыхлой пестик, А, а затем от пяти до 10 ударов жесткой пестик, B.Avoid подъема гомогенизатора за пределами раствора лиза между ударами, и избежать введения пузырьков. Теперь поместите 40 микрон ситечко над предварительно охлажденной 50 миллилитров конической трубки и предварительно мокрый с одним миллилитр низкой сахарозы буфера.
Добавьте один миллилитр низкого буфера сахарозы к гомогенизатору Dounce, содержащем сырые ядра в буфере лиза, и аккуратно перемешайте, трубя два-три раза. Перейти сырой ядра подготовки над 40-микрон ситечко, в предварительно охлажденной 50 миллилитров конической трубки. Пройди еще один миллилитр низкой сахарозы буфера над 40 микрон ситечко, в результате чего окончательный объем до трех миллилитров низкой сахарозы буфера и 500 микролитров буфера лиза.
Повторите эти шаги, если объединить несколько шнуров, охлаждение в той же конической трубки. Затем центрифуга образца в 3200 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После того, как центрифугация завершена, декантировать супернатант.
Мы приостанавливаем палитру, используя три миллилитров низкого буфера сахарозы. Аккуратно вихрем, чтобы удалить гранулы со стены, чтобы облегчить повторное успение. После того, как образец будет сидеть на льду в течение двух минут, перенесите подвеску в трубку Oak Ridge.
Используя гомогенизатор при установке одного, гомогенизировать ядра в буфер низкой сахарозы в течение 15 до 30 секунд, сохраняя образец на льду. Затем используйте серологическую пипетку, чтобы слой 12,5 миллилитров буфера плотности сахарозы, под низким гогенатом буфера сахарозы, заботясь, чтобы не создать пузырь, который нарушает плотность слоев. Центрифуга труб при 3200 раз G, в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию.
После того, как центрифугация завершена, немедленно decant supernatant в стряхивая движения. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы немедленно удалить трубку Oak Ridge из центрифуги, и быстро decant супернатант. Используя 100 микролитров до одного миллилитра раствора повторного незаменимия, мы приостанавливаем ядра, оставшиеся на стене.
Избегайте миелин хмуриться, что остается с моющим средством на основе подготовки. Невыполнение этих шагов быстро может привести к подготовке ядер с избытком клеточного мусора, или миелина, который может препятствовать секвенированию РНК ниже по течению. Фильтр ядра через 30 до 35 микрон пор размер ситечко и собирать в предварительно охлажденной трубки.
Определите выход ядер, используя гемоцитометр для подсчета ядер под целью 10 х, прежде чем приступить к одноядерной РНК секвенирования, как описано в текстовом протоколе. Яркие полевые и эпифлюоресцентные изображения ядер, изолированных с помощью протокола механического лиза моющего средства, показаны на уровне 10 x. Эти ядра изолированы непредвзято, что позволяет изучать профили экспрессии эндогенных генов на уровне одной клетки.
Здесь показан репрезентативный участок tSNE одноядерного РНК секвенирования, от поясничного спинного мозга мыши, используя массивно параллельную платформу инкапсуляции капель. Ядра, изолированные от свежих или замороженных тканей, могут использоваться для секвенирования как на коммерческих, так и на академических платформах. Этот метод позволяет исследователям исследовать транскрипционные профили на одноклеточном уровне, используя трудноразобщенные ткани, такие как спинной мозг, или даже замороженные ткани, такие как биобанковый материал.
При попытке этой процедуры, важно, чтобы уменьшить количество времени между эвтаназией и клеточного лиза. Кроме того, важно свести к минимуму пузырьки, введенные в растворы от клеточного лиза до повторного успенения, и купить ядра домашних животных с осторожностью. Следуя этой процедуре, ядра могут быть использованы для альтернативных приложений, таких как сортировка факсов, для того, чтобы изолировать определенные типы клеток.
