يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال النزف الدماغي الدقيق مثل المسببات، والتوزيع، والكشف عن النزيف الدماغي الدقيق وهلم جرا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن حقن LPS تستحث الالتهاب بشكل ثابت. بالإضافة إلى ذلك، حقن LPS بسيط جداً، اقتصادية، وفعالة من حيث التكلفة.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في الحث نزيف الدماغ، ويمكن أيضا أن تطبق على اضطرابات الدماغ الأخرى مثل الاكتئاب، والفصام، ومرض باركنسون، ومرض الزهايمر، ومرض البريون. إدارة LPS بجرعة من ملليغرام واحد لكل كيلوغرام من وزن الجسم ل10 أسابيع الذكور الجرذان Doley Sprague عن طريق الحقن داخل الصفتون، ثم العودة كل الفئران إلى القفص المنزلي. كرر حقن LPS بعد ست ساعات و 16 ساعة.
يرجى ملاحظة أن حقن الفئران SD مع LPS بجرعة من مليغرام واحد للكيلوغرام الواحد قد يؤدي إلى 5٪ وفيات. ويمكن أن يزداد معدل الوفيات في الجرذان الأصغر سنا أو الأكبر سنا أو الجرذان الحامل. إعادة الفئران إلى أقفاصها بعد حقن LPS، وتوفير الإعلان libitum الوصول إلى الطعام والشراب.
تحت التخدير النهائي، قم بإجراء ثقب قلبي عميق من 5 إلى 8 ملليمترات على كل جرذ. يجب أن تكون نقطة الثقب خمسة ملليمترات إلى الهامش الأيسر من القص في الفضاء الوربي الثالث والرابع. عقد الإبرة في مكان واستبدال أنبوب فارغ مع أنبوب يحتوي على ايفانز الأزرق.
انتظر حتى يتم ملاحظة استعادة الدم ، ثم حقن ايفانز الأزرق بجرعة من 0.2 ملليلتر لكل 100 غرام من وزن الجسم في البطين الأيسر للقلب. إبقاء الفئران في موقف supine لمدة 10 دقائق إذا تقييم ايفانز تسرب الأزرق من خلال حاجز الدم / الدماغ عن طريق التصوير المناعي. إجراء ضخ القلب باستخدام الجليد الباردة 200 إلى 300 ملليلتر من 0.9٪ محلول ملحي لمسح الأوعية الدموية الدماغية والعقول.
التحول إلى الجليد الباردة 4٪ شبهformaldehyde لتثبيت. ثم، بعد عزل الدماغ، غمره في 20٪ من السكروز في برنامج تلفزيوني لمدة ست ساعات على الأقل أو حتى يغرق الدماغ إلى أسفل الأنبوب. تغيير الحل إلى 30٪ السكروز وإصلاحه لمدة ست ساعات أخرى.
وأخيراً، أعد أقسام أنسجة الدماغ السميكة 10 ملليمتر باستخدام جهاز التبريد. غسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من هذه، ثم احتضان الشرائح مع 4، 6'diamidino-2-فينيليندول أو DAPI حل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الشرائح في برنامج تلفزيوني كما كان من قبل، تحميل الشرائح مع برنامج تلفزيوني- محلول الجلسرين.
التقاط الصور على المجهر المفلور. يشار إلى ترسب EB بواسطة الفلوري الأحمر ، ويشار إلى النوى من قبل الفلورسينس الأزرق. ابدأ تلطّخ H&E عن طريق غسل الشرائح في الماء المقطر.
ثم تزج في حل الهماوكسيلين لمدة ثماني دقائق. بدلا من ذلك، لبيرل البروسية الأزرق تلطيخ، وصمة عار في حل رد فعل مع خليط متساو أجزاء من حمض ferrocyanide وحمض الهيدروكلوريك لمدة 10 دقائق. بعد تلطيخ، وغسل في مياه الصنبور الجارية لمدة خمس دقائق.
التفريق في 1٪ من الكحول الحمضي لمدة 30 ثانية. بعد الغسيل في مياه الصنبور الجارية لمدة دقيقة واحدة، وصمة عار في 0.2٪ ماء الأمونيا أو محلول كربونات الليثيوم المشبعة لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة. بعد ذلك، اغسل في مياه الصنبور الجارية لمدة خمس دقائق.
مضادة للصم مع حل إيوسين لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة. الجفاف من خلال 90٪ الكحول، ثم 95٪، والكحول المطلق لمدة 0.5 إلى دقيقتين لكل منهما. بعد الجفاف، واضحة في إكسيلين لمدة 30 ثانية.
بعد التركيب، تحليل تلطيخ H & E باستخدام المجهر الفلوريfield. تظهر خلايا الدم الحمراء المُطلقة من الأوعية الدموية، وهي مكونات لـ CMHs، في اللون الأحمر البرتقالي تحت تلطيخ H&E. يمكن الكشف عن CMHs السطح من قبل المراقبة الإجمالية كما هو مبين من قبل السهام الحمراء.
ايفانز الأزرق تلطيخ يكشف الفلوريسين الأحمر مرئية حيث ايفانز الجزيئات الزرقاء تسربت من حاجز الدم في الدماغ المصاب. يُظهر تلطيخ H&E خلايا الدم الحمراء الموجودة خارج الشعيرات الدموية، ويكشف التلطين البروسية عن نقاط أيونات الحديديك المشتقة من تحلل خلايا الدم الحمراء. أثناء محاولة هذا الإجراء, من المهم أن نتذكر أن جرعة من LPS للحث على الدماغ الجزئي النزيف أكبر من تلك المستخدمة في مرض باركنسون أو نموذج الفصام.
ولذلك، ينبغي الحفاظ على بيئة الحيوانات نظيفة للحد من معدل الوفيات. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المجهر الإلكتروني، والتصوير بالرنين المغناطيسي، والتصوير المناعي لتحديد الضرر الذي لحق بالبنية الخارجية لحواجز الدم في الدماغ في النزيف الدماغي الدقيق، وتوزيع نزيف الدماغ الدقيق في الدماغ parenchyma في الجسم الحي، فضلا عن تنشيط الخلايا الدبقية.
