Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da micromorragem cerebral, como a etiologia, distribuição e detecção de micromorragem cerebral e assim por diante. A principal vantagem desta técnica é que as injeções de LPS induzem a inflamação. Além disso, a injeção de LPS é bastante simples, econômica e econômica.
Embora este método possa fornecer uma visão da indução da hemorragia cerebral, ele também pode ser aplicado a outros distúrbios cerebrais, como depressão, esquizofrenia, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e doença de prída. Administre LPS a uma dose de um miligrama por quilograma de peso corporal para ratos sprague dawley machos de 10 semanas de idade por injeção intraperitoneal, em seguida, retornar cada rato para a gaiola doméstica. Repita a injeção de LPS após seis horas e 16 horas.
Observe que injetar ratos SD com LPS a uma dose de um miligrama por quilograma pode resultar em uma mortalidade de 5%. A mortalidade pode aumentar ainda mais em ratos mais jovens ou mais velhos ou ratos fêmeas grávidas. Devolva os ratos para suas gaiolas após a injeção de LPS, e forneça acesso a ad libitum a alimentos e bebidas.
Sob anestesia terminal, realize uma punção cardíaca profunda de cinco a oito milímetros em cada rato. O ponto de punção deve ser de cinco milímetros para a margem esquerda do esterno no terceiro e quarto espaço intercostal. Segure a agulha no lugar e substitua o tubo vazio por um tubo contendo azul Evans.
Espere até que a recuperação sanguínea seja observada, e então injete evans azul em uma dose de 0,2 mililitros por 100 gramas de peso corporal no ventrículo cardíaco esquerdo. Mantenha o rato em posição supina por 10 minutos se avaliar o vazamento azul de Evans através da barreira sanguínea/cerebral por imagens de imunofluorescência. Realize perfusões cardíacas usando 200 a 300 mililitros de solução salina de 0,9% para limpar a vasculatura cerebral e os cérebros.
Mude para gelo 4% paraformaldeído para fixação. Então, depois de isolar o cérebro, mergulhe-o em 20% de sacarose na PBS por pelo menos seis horas ou até que o cérebro afunde no fundo do tubo. Mude a solução para 30% de sacarose e fixe-a por mais seis horas.
Finalmente, prepare seções de tecido cerebral de 10 milímetros de espessura usando um criostat. Lave os slides com PBS três vezes por cinco minutos cada, depois incuba slides com solução de 4,6'diamidino-2-fenilômado ou DAPI por 15 minutos à temperatura ambiente. Depois de lavar os slides em PBS como antes, monte os slides com solução PBS-gliceol.
Capture imagens em um microscópio de fluorescência. A deposição do EB é indicada por fluorescência vermelha, núcleos são indicados por fluorescência azul. Comece a coloração de H&E lavando as lâminas em água destilada.
Em seguida, mergulhe na solução de hematoxilina por oito minutos. Alternativamente, para a coloração azul perl prussiana, colorir em solução de reação com mistura de peças iguais de ferrociídeo e ácido clorídrico por 10 minutos. Após a coloração, lave na água da torneira por cinco minutos.
Diferencie em 1% álcool ácido por 30 segundos. Depois de lavar em água da torneira por um minuto, manche em 0,2% água de amônia ou solução de carbonato de lítio saturado por 30 segundos a um minuto. Em seguida, lave na água da torneira por cinco minutos.
Contra-mancha com solução de eosina por 30 segundos a um minuto. Desidratar através de 90%, depois 95% de álcool e álcool absoluto por 0,5 a dois minutos cada. Depois da desidratação, limpe em xileno por 30 segundos.
Após a montagem, analise a coloração de H&E usando um microscópio de fluorescência de campo brilhante. Os glóbulos vermelhos liberados dos vasos sanguíneos, que são componentes dos CMHs, aparecem em laranja-vermelha sob a coloração de H&E. CmHs de superfície podem ser detectados por observação bruta, conforme indicado pelas setas vermelhas.
A coloração azul de Evans revela fluorescência vermelha visível onde moléculas azuis de Evans vazaram de uma barreira hemoencefálica ferida. A coloração de H&E mostra glóbulos vermelhos encontrados fora dos capilares, e a coloração prussiana revela pontos de íons férricos derivados de lise de glóbulos vermelhos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a dose de LPS para induzir micro-hemorragia cerebral é maior do que a usada na doença de Parkinson ou modelo de esquizofrenia.
Portanto, o ambiente dos animais deve ser mantido limpo para reduzir a taxa de mortalidade. Após este procedimento, outros métodos como microscopia eletrônica, ressonância magnética e imagem imunofluorescente poderiam ser realizados para determinar o dano à estrutura externa da barreira hematoencefálica na micromorrização cerebral, distribuição de micro-hemorragias cerebrais no parenchyma cerebral in vivo, bem como ativação de células gliais.
