Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la micro-hemorragia cerebral, como la etiología, la distribución y la detección de micro-hemorragia cerebral, etc. La principal ventaja de esta técnica es que las inyecciones de LPS inducen inflamación de forma estable. Además, la inyección de LPS es bastante simple, económica y rentable.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la inducción de hemorragia cerebral, también se puede aplicar a otros trastornos cerebrales como depresión, esquizofrenia, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, y la enfermedad de priones. Administrar LPS a una dosis de un miligramo por kilogramo de peso corporal a ratas Sprague Dawley macho de 10 semanas de edad por inyección intraperitoneal, luego devolver cada rata a la jaula de origen. Repita la inyección de LPS después de seis horas y 16 horas.
Tenga en cuenta que la inyección de ratas SD con LPS a una dosis de un miligramo por kilogramo puede dar lugar a una mortalidad del 5%. La mortalidad podría aumentar aún más en ratas más jóvenes o mayores o ratas hembra embarazadas. Devuelva a las ratas a sus jaulas después de la inyección de LPS, y proporcione acceso ad libitum a alimentos y bebidas.
Bajo anestesia terminal, realice una punción cardíaca de cinco a ocho milímetros de profundidad en cada rata. El punto de punción debe ser de cinco milímetros al margen izquierdo del esternón en el tercer y cuarto espacio intercostal. Sujete la aguja en su lugar y reemplace el tubo vacío por un tubo que contenga el azul Evans.
Espere hasta que se observe la recuperación de sangre, y luego inyecte Evans azul a una dosis de 0,2 mililitros por cada 100 gramos de peso corporal en el ventrículo izquierdo del corazón. Mantenga a la rata en posición supina durante 10 minutos si evalúa la fuga de azul de Evans a través de la barrera hematoencefálica mediante imágenes de inmunofluorescencia. Realizar perfusiones cardíacas utilizando hielo-frío 200 a 300 mililitros de 0.9%solución salina para limpiar la vasculatura cerebral y el cerebro.
Cambie a hielo frío 4%paraformaldehído para fijación. Luego, después de aislar el cerebro, sumérgelo en 20%sacarosa en PBS durante al menos seis horas o hasta que el cerebro se hunda en la parte inferior del tubo. Cambie la solución a 30%sucrose y arrójela durante otras seis horas.
Finalmente, prepara secciones de tejido cerebral de 10 milímetros de grosor usando un criostato. Lave los portaobjetos con PBS tres veces durante cinco minutos cada uno y luego incubar los portaobjetos con 4, 6'diamidino-2-fenilindole o solución DAPI durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar los portaobjetos en PBS como antes, monte los portaobjetos con solución pbS-glicerol.
Captura imágenes en un microscopio de fluorescencia. La deposición EB está indicada por fluorescencia roja, los núcleos están indicados por fluorescencia azul. Comience la tinción de H&E lavando los portaobjetos en agua destilada.
A continuación, sumerja en solución de hematoxilina durante ocho minutos. Alternativamente, para la tinción azul prusiana Perl, manchar en la solución de reacción con mezcla de partes iguales de ferrocianuro y ácido clorhídrico durante 10 minutos. Después de la tinción, lavar en agua corriente del grifo durante cinco minutos.
Diferenciar en 1% de alcohol ácido durante 30 segundos. Después de lavar en agua corriente del grifo durante un minuto, manche en 0.2%agua de amoníaco o solución saturada de carbonato de litio durante 30 segundos a un minuto. A continuación, lavar en agua corriente del grifo durante cinco minutos.
Contramancha con solución de eosina durante 30 segundos a un minuto. Deshidratar a través de 90%alcohol, luego 95%alcohol, y alcohol absoluto durante 0.5 a dos minutos cada uno. Después de la deshidratación, transparente en xileno durante 30 segundos.
Después del montaje, analice la tinción H&E con un microscopio de fluorescencia de campo brillante. Los glóbulos rojos liberados de los vasos sanguíneos, que son componentes de las CMH, aparecen en rojo-naranja bajo la tinción de H&E. Las CMH de superficie se pueden detectar mediante la observación bruta, como indican las flechas rojas.
La tinción azul de Evans revela fluorescencia roja visible donde las moléculas azules de Evans se filtraban de una barrera hematoencefálica lesionada. La tinción de H&E muestra glóbulos rojos encontrados fuera de los capilares, y la tinción prusiana revela puntos de iones férricos derivados de la lisis de los glóbulos rojos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la dosis de LPS para inducir la micro-hemorragia cerebral es mayor que la utilizada en la enfermedad de Parkinson o modelo de esquizofrenia.
Por lo tanto, el medio ambiente de los animales debe mantenerse limpio para reducir la tasa de mortalidad. Después de este procedimiento, se podrían realizar otros métodos como microscopía electrónica, resonancia magnética e imágenes inmunofluorescentes para determinar el daño a la estructura externa de la barrera hematoencefálica en la microb hemorragia cerebral, la distribución de micropermor hemorragias cerebrales en el parénquima cerebral in vivo, así como la activación de células gliales.
