Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микроморрагии головного мозга, такие как этиология, распределение и обнаружение микроморрагии головного мозга и так далее. Основным преимуществом этой техники является то, что инъекции LPS ударно вызывают воспаление. Кроме того, инъекция LPS довольно проста, экономична и рентабельна.
Хотя этот метод может обеспечить понимание индукции кровоизлияния в мозг, он также может быть применен к другим расстройствам мозга, таким как депрессия, шизофрения, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, и прионные заболевания. Администрирование LPS в дозе одного миллиграмма на килограмм массы тела 10-недельного самца Sprague Dawley крыс путем внутриперитонеальной инъекции, а затем вернуть каждую крысу в домашнюю клетку. Повторите инъекцию LPS через шесть часов и 16 часов.
Пожалуйста, обратите внимание, что введение SD крыс с LPS в дозе одного миллиграмма на килограмм может привести к 5% смертности. Смертность может еще больше возрасти у молодых или пожилых крыс или беременных самок крыс. Вернуть крыс в свои клетки после инъекции LPS, и обеспечить доступ к рекламе libitum к пище и напиткам.
Под терминальной анестезией выполните пяти-восьмимиллиметровый глубокий сердечный прокол на каждой крысе. Точка прокола должна быть пять миллиметров к левому краю грудины в третьем и четвертом межреберном пространстве. Держите иглу на месте и замените пустую трубку трубкой, содержащей синий Эванс.
Подождите, пока восстановление крови наблюдается, а затем ввести Эванс синий в дозе 0,2 миллилитров на 100 граммов массы тела в левый желудочек сердца. Держите крысу в положении на спине в течение 10 минут, если оценить Эванс синий утечки через кровь / мозг барьер иммунофторесценции изображений. Выполните сердечные перфузии с помощью ледяных 200 до 300 миллилитров 0,9% солевого раствора, чтобы очистить сосуды головного мозга и мозг.
Переключитесь на ледяной 4%paraformaldehyde для фиксации. Затем, после изоляции мозга, погрузить его в 20% сахарозы в PBS, по крайней мере шесть часов или до тех пор, пока мозг опускается на дно трубки. Измените раствор на 30% сахарозы и починьте его еще на шесть часов.
Наконец, подготовь 10-миллиметровые толстые секции тканей мозга с помощью криостата. Вымойте слайды с PBS три раза в течение пяти минут каждый, а затем инкубировать слайды с 4, 6'diamidino-2-фенилиндол или DAPI решение в течение 15 минут при комнатной температуре. После мытья слайдов в PBS, как и прежде, смонтировать слайды с PBS-глицерол раствор.
Захват изображений на флуоресцентный микроскоп. Осаждение EB указывается красной флуоресценцией, ядра указываются синим флуоресценцией. Начните Окрашивание Н И Е, стирая горки в дистиллированной воде.
Затем погрузитесь в раствор гематоксилина в течение восьми минут. Кроме того, для Перл прусского синего окрашивания, пятно в реакционной растворе с равными частями смеси ферроцианида и соляной кислоты в течение 10 минут. После окрашивания, мыть в проточной водопроводной воде в течение пяти минут.
Дифференцировать в 1%кислотный спирт в течение 30 секунд. После мытья в проточной водопроводной воде в течение одной минуты, пятно в 0,2%ammonia воды или насыщенных карбонатного раствора лития в течение 30 секунд до одной минуты. Затем, мыть в проточной водопроводной воде в течение пяти минут.
Контр-пятно с эозиным раствором в течение 30 секунд до одной минуты. Обезвоживание через 90% алкоголя, то 95% алкоголя, и абсолютный алкоголь в течение 0,5 до двух минут каждый. После обезвоживания, ясно в ксилена в течение 30 секунд.
После монтажа проанализируйте Окрашивание Н И Э с помощью яркого флуоресцентной микроскопа. Красные кровяные тельца, высвобождаемые из кровеносных сосудов, которые являются компонентами CMHs, появляются в красно-оранжевом под H и E окрашивания. Поверхностные CMH могут быть обнаружены путем грубого наблюдения, как указано красными стрелками.
Эванс синий окрашивания показывает видимые красные флуоресценции, где Эванс синие молекулы просочились из травмированного геммохового барьера. H и E окрашивание показывает красные кровяные тельца, найденные за пределами капилляров, и прусские окрашивания показывает ионные точки, полученные из лиза красных кровяных телец. При попытке этой процедуры, важно помнить, что доза LPS, чтобы вызвать микро-кровоизлияние головного мозга больше, чем при болезни Паркинсона или шизофрении модели.
Поэтому окружающая среда животных должна быть чистой, чтобы снизить смертность. После этой процедуры, другие методы, такие как электронная микроскопия, магнитно-резонансная томография, и иммунофлюоресцентной визуализации могут быть выполнены для определения повреждения внешней структуры гем blood-brain барьера в мозге микро-кровоизлияния, распределение мозговых микро-кровоизлияний в мозг паренхима в виво, а также активации глиальных клеток.
