该方法有助于回答脑微出血领域的关键问题,如脑微出血的病因、分布、检测等。该技术的主要优点是LPS注射稳定诱导炎症。此外,LPS 喷射非常简单、经济且经济高效。
虽然这种方法可以提供脑出血诱导的见解,它也可以应用于其他脑部疾病,如抑郁症,精神分裂症,帕金森病,阿尔茨海默病,和普里昂病。以每公斤体重1毫克的剂量对10周大的雄性Sprague Dawley大鼠进行LPS注射,然后将每只大鼠返回到家庭笼子。6 小时 16 小时后重复 LPS 注射。
请注意,以每公斤1毫克的剂量注射SD大鼠可能导致5%的死亡率。年轻或年长的大鼠或怀孕雌性大鼠的死亡率可能进一步上升。LPS 注射后将大鼠返回到笼子,并提供食食物和饮料。
在末期麻醉下,对每只大鼠进行五到八毫米的深度心脏穿刺。在第三和第四个间空间处,刺破点应为胸骨左边缘五毫米。将针头握到位,用含有埃文斯蓝色管的管子更换空管。
等到血液恢复被观察,然后注射埃文斯蓝的剂量0.2毫升每100克的体重到左心室。如果通过免疫荧光成像评估埃文斯蓝漏通过血液/大脑屏障,请将大鼠保持10分钟的超供状态。使用冰冷 200 至 300 毫升 0.9% 盐水溶液进行心脏灌注,以清除脑血管和大脑。
切换到冰冷4%甲醛固定。然后,在隔离大脑后,在PBS中浸入20%蔗糖至少6个小时,或直到大脑沉入管底。将溶液更改为 30%蔗糖,再修复 6 小时。
最后,使用低温恒温器准备10毫米厚的脑组织部分。用 PBS 清洗幻灯片三次,每次五分钟,然后用 4,6'diamidino-2-苯酚或 DAPI 溶液在室温下孵育幻灯片 15 分钟。在 PBS 中像之前一样清洗幻灯片后,使用 PBS-甘油溶液安装幻灯片。
在荧光显微镜上捕捉图像。EB沉积用红色荧光表示,核用蓝色荧光表示。在蒸馏水中清洗滑梯,开始 H&E 染色。
然后浸入赤氧树脂溶液8分钟。或者,对于P应普鲁士蓝色染色,在反应溶液中染色,用铁氰化物和盐酸等件混合物10分钟。染色后,用自来水清洗五分钟。
在 1%酸醇中区分 30 秒。在自来水中洗涤1分钟后,在0.2%氨水或饱和碳酸锂溶液中染色30秒至1分钟。接下来,用自来水洗五分钟。
用 eosin 溶液防污 30 秒至 1 分钟。通过90%酒精脱水,然后95%酒精,绝对酒精每0.5至2分钟。脱水后,用二甲苯清除30秒。
安装后,使用亮场荧光显微镜分析 H&E 染色。从血管中释放的红血球是CCM的成分,在H&E染色下以红橙色出现。表面CCMH可以通过红色箭头指示的毛观测来检测。
埃文斯蓝色染色揭示了明显的红色荧光,其中埃文斯蓝色分子从受伤的血脑屏障泄漏。H&E染色显示毛细管外发现的红血球,普鲁士染色显示从红血球的解解中得出的铁离子点。在尝试此程序时,重要的是要记住,LPS 诱导脑微出血的剂量大于帕金森病或精神分裂症模型中使用的剂量。
因此,动物的环境应保持清洁,以降低死亡率。按照这个程序,可以执行电子显微镜、磁共振成像和免疫荧光成像等方法,以确定脑微出血中血脑屏障外层结构的损伤、体内脑微出血的分布以及胶质细胞活化。