이 방법은 뇌미세출혈 등의 뇌성 미세 출혈 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 LPS 주사가 안정적으로 염증을 유발한다는 것입니다. 또한 LPS 주입은 매우 간단하고 경제적이며 비용 효율적입니다.
이 방법은 뇌 출혈 유도에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만 우울증, 정신 분열증, 파킨슨 병, 알츠하이머 병 및 프리온 질병과 같은 다른 뇌 질환에도 적용 될 수 있습니다. 10 주 된 남성 Sprague Dawley 쥐 에 체중의 킬로그램 당 1 밀리 그램의 복용량에 LPS를 관리 하 여 복막 주사에 의해 쥐를 반환 하 고 홈 케이지에 각 쥐를 반환. 6시간 16시간 후에 LPS 주사를 반복합니다.
킬로그램 당 1 밀리 그램의 복용량에 LPS와 SD 쥐를 주입 하는 것은 발생할 수 있습니다 유의 하시기 바랍니다 5% 사망률. 사망률은 더 젊거나 오래된 쥐 또는 임신한 여성 쥐에서 더 증가할 수 있었습니다. LPS 주사 후 쥐를 케이지로 돌려보내 음식과 음료에 대한 광고 리비도 액세스를 제공합니다.
말기 마취하에 각 쥐에 5~8밀리미터 깊이의 심장 천자를 수행합니다. 천지 점은 세 번째와 네 번째 늑간 공간에서 흉골의 왼쪽 여백에 5 밀리미터여야합니다. 바늘을 제자리에 잡고 빈 튜브를 에반스 블루가 들어있는 튜브로 교체하십시오.
혈액 회복이 관찰 될 때까지 기다린 다음 왼쪽 심장 심실에 체중 100 그램 당 0.2 밀리리터의 복용량에서 에반스 블루를 주입하십시오. 면역 형광 영상에 의해 혈액 / 뇌 장벽을 통해 에반스 블루 누출을 평가하는 경우 10 분 동안 쥐를 supine 위치에 보관하십시오. 뇌 혈관과 뇌를 지우기 위해 0.9% 식염수용의 얼음 감기 200~300밀리리터를 사용하여 심장 관류를 수행합니다.
고정을 위해 얼음 차가운 4 % 파라 포름 알데히드로 전환합니다. 그런 다음 뇌를 고립 한 후 PBS에서 적어도 6 시간 동안 또는 뇌가 튜브 바닥으로 가라 앉을 때까지 20 % 자당에 담가십시오. 솔루션을 30% 자당으로 변경하고 6시간 동안 수정합니다.
마지막으로, 냉동고를 사용하여 10 mm 두께의 뇌 조직 섹션을 준비하십시오. 각각 5분 동안 PBS로 슬라이드를 세 번 세척한 다음, 실온에서 15분 동안 4, 6'diamidino-2-phenylindole 또는 DAPI 용액으로 슬라이드를 배양합니다. 이전과 같이 PBS에서 슬라이드를 세척 한 후 PBS-글리세롤 용액으로 슬라이드를 장착하십시오.
형광 현미경에 이미지를 캡처합니다. EB 증착은 적색 형광으로 표시되며, 핵은 청색 형광으로 표시된다. 증류수에 슬라이드를 세척하여 H&E 염색을 시작합니다.
그런 다음 헤마톡시린 용액에 8분 간 담가 두는 것입니다. 또는, 펄 프로이센 블루 염색의 경우, 10 분 동안 페로시아니드와 염산의 동등한 부분 혼합물로 반응 용액에 얼룩. 염색 후, 5 분 동안 흐르는 수돗물로 씻어.
30초 동안 1%의 산성 알코올을 분화합니다. 1분 동안 흐르는 수돗물로 세척한 후, 0.2% 암모니아 수또는 포화 리튬 탄산용용액을 30초에서 1분 동안 더럽히고 있습니다. 다음으로, 흐르는 수돗물로 5분간 씻으시면 됩니다.
에오신 용액을 30초에서 1분 동안 사용하여 역얼룩을 처리합니다. 90%의 알코올, 95%의 알코올, 절대 알코올을 각각 0.5~2분 동안 탈수합니다. 탈수 후 30초 동안 자일렌으로 치우치게 됩니다.
장착 후 밝은 필드 형광 현미경을 사용하여 H&E 염색을 분석합니다. CMHs의 성분인 혈관에서 방출되는 적혈구는 H&E 염색 하에 적색 주황색으로 나타납니다. 표면 CMHs는 빨간색 화살표에 의해 표시된 대로 총 관찰에 의해 검출될 수 있습니다.
에반스 블루 스테인링은 에반스 블루 분자가 부상당한 혈액-뇌 장벽에서 유출된 눈에 보이는 붉은 형광을 보여줍니다. H&E 염색은 모세혈관 외부에서 발견되는 적혈구를 보여주고, 프로이센 염색은 적혈구의 용해에서 유래한 페리 이온 점을 드러낸다. 이 절차를 시도하는 동안, 대뇌 미세 출혈을 유도하는 LPS의 복용량이 파킨슨 병 이나 정신 분열증 모델에서 사용되는 것보다 더 크다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
따라서, 동물의 환경은 사망률을 줄이기 위해 깨끗하게 유지되어야한다. 이 절차에 이어, 전자 현미경 검사법, 자기 공명 화상 진찰 및 면역 형광 화상 진찰과 같은 그밖 방법은 뇌 미세 출혈에 있는 혈액-뇌 장벽의 외부 구조물에 손상을 결정하기 위하여 수행될 수 있었습니다, 생체내 뇌 parenchyma에 있는 뇌성 미세 출혈의 분포, 뿐만 아니라 신경교 세포 활성화.
