この方法は、脳の微小出血の病因、分布、および脳微小出血の検出などの脳微小出血分野における重要な質問に答える助けとなります。この技術の主な利点は、LPS注射が安定して炎症を誘発することです。さらに、LPSの注入は非常に簡単で経済的で、費用効果が大きい。
この方法は脳出血誘導に関する洞察を提供することができますが、うつ病、統合失調症、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病などの他の脳障害にも適用できます。腹腔内注射によって10週齢の雄のスプレイグ・ドーレーラットに体重1キログラムあたり1ミリグラムの用量でLPSを投与し、その後、ホームケージに各ラットを返す。6時間16時間後にLPS注入を繰り返します。
1キログラムあたり1ミリグラムの用量でLPSでSDラットを注入すると、5%の死亡率をもたらすことに注意してください。死亡率は、若いラットまたは高齢のラットまたは妊娠中の女性ラットでさらに増加する可能性があります。LPS注射後にラットをケージに戻し、食べ物や飲み物へのアドリビタムアクセスを提供します。
末期麻酔下では、各ラットに5〜8ミリメートルの深心穿刺を行う。穿刺点は、3番目と4番目の肋間空間で胸骨の左マージンに5ミリメートルでなければなりません。針を所定の位置に保持し、空のチューブをエバンスブルーを含むチューブに置き換えます。
血液回復が観察されるまで待ってから、エバンスブルーを100グラムの体重当たり0.2ミリリットルの用量で左心室に注入する。免疫蛍光イメージングによって血液/脳関門を通るエバンスブルー漏れを評価する場合は、ラットを10分間のサイン位置に保ちます。0.9%の生理食塩水の氷冷200〜300ミリリットルを使用して心臓灌流を行い、脳血管系と脳をクリアします。
氷冷4%パラホルムアルデヒドに切り替えて固定します。次いで、脳を単離した後、少なくとも6時間、または脳がチューブの底に沈むまでPBSで20%スクロースに浸す。溶液を30%スクロースに変更し、さらに6時間修正します。
最後に、クライオスタットを使用して10ミリメートルの厚さの脳組織切片を準備します。スライドをそれぞれ5分間3回PBSで洗い、4、6'diamidino-2-フェニリンドールまたはDAPI溶液でスライドを室温で15分間インキュベートします。前と同様にPBSでスライドを洗浄した後、PBS-グリセロール溶液でスライドを取り付ける。
蛍光顕微鏡で画像をキャプチャします。EB沈着は赤色蛍光によって示され、核は青色蛍光によって示される。蒸留水でスライドを洗ってH&E染色を開始します。
その後、ヘマトキシリン溶液に8分間浸漬する。あるいは、ペル・プロイセンブルー染色の場合、フェロシアン化物と塩酸の等分混合物を10分間混合して反応液中に染色する。染色後、水道水を5分間洗います。
1%のアルコールを30秒間分化します。水道水を1分間流して洗浄した後、0.2%アンモニア水または飽和炭酸リチウム溶液を30秒から1分間染色します。次に、水道水を5分間洗います。
エオシン溶液を用いて30秒~1分間の抗染色剤。90%アルコール、95%アルコール、および各0.5〜2分間の絶対アルコールを脱水します。脱水後、キシレンで30秒間クリアします。
取り付け後、明視野蛍光顕微鏡を使用してH&E染色を分析します。CmHの成分である血管から放出される赤血球は、H&E染色の下で赤オレンジ色に現れる。表面のCmHは、赤い矢印で示されるように総観測によって検出することができます。
エバンスブルー染色は、エバンスブルー分子が負傷した血液脳関門から漏れた目に見える赤い蛍光を明らかにする。H&E染色は毛細血管の外に見られる赤血球を示し、プロイセン染色は赤血球のリシスに由来する鉄イオン点を明らかにする。この手順を試みる間、脳微小出血を誘導するLPSの用量は、パーキンソン病または統合失調症モデルで使用されるよりも大きいことを覚えておくことが重要です。
したがって、動物の環境は、死亡率を減らすために清潔に保たれるべきである。この手順に従って、電子顕微鏡、磁気共鳴画像法、免疫蛍光イメージングなどの他の方法を行い、脳内脳小出血における血液脳関門の外構造の損傷、脳内の脳のパレンチマにおける脳内小出血の分布、ならびにグリア細胞活性化を決定することができる。
