يوفر هذا البروتوكول فهما متعدد الأوجه لتنشيط عمليات موت الخلايا ، والتي يمكن أن توفر رؤى نقدية حول آليات المرض وإبلاغ الاستراتيجيات العلاجية. يعتمد هذا البروتوكول على استخدام تقنية أبسط والوصول إلى تنشيط caspases متعددة حتمية من مجموعة واحدة من الخلايا الداخلية لتحديد التنشيط بشكل كبير. وقد تورط موت الخلايا المناعية الفطرية عبر طيف المرض ، من العدوى إلى الأمراض الالتهابية إلى السرطانات.
يمكن أن يوفر فهم الآليات الجزيئية لموت الخلايا من خلال تنشيط الكاسباز رؤى مهمة لعمليات المرض. سيقوم الدكتور جوليان ، وهو باحث مشارك في مرحلة ما بعد الدكتوراه من أحد المختبرات ، بتوضيح الإجراء. بعد عزل نخاع العظم والتمييز بين BMDMs ، تصيب الخلايا بفيروس الأنفلونزا A.
احسب حجم الفيروس المطلوب عند تعدد العدوى من 20 وحدة تشكيل البلاك. قم بإزالة الوسائط من BMDMs واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 500 ميكرولتر من PBS. أضف 450 ميكرولترا من فيروس الأنفلونزا A في DMEM عالي الجلوكوز بدون FBS المعطل بالحرارة إلى كل بئر ، واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في حاضنة مرطبة للسماح بالامتصاص.
في نهاية الحضانة لمدة ساعة واحدة ، أضف 50 ميكرولترا من FBS المعطل بالحرارة وأعد الألواح إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. بعد 12 ساعة من الحضانة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة. نضح 150 ميكرولتر من المادة الطافية وتجاهل أو احفظها لتحليل الطاف.
لا تقم بإزالة المادة الطافية المتبقية. الآن ، قم بإنشاء محلول جمع البروتين من خلال الجمع بين 50 ميكرولترا من محلول تحلل الكاسباز و 100 ميكرولتر من أربعة مخزن مؤقت XSDS لكل بئر. ثم أضف 150 ميكرولترا من المزيج إلى كل بئر.
لكل بئر ، ماصة الخليط لجمع الخلايا المحللة والطاف. أثناء السحب ، اكشط قاع البئر بطرف الماصة لتعطيل الخلايا. بعد الكشط والماصة ، اجمع البروتين المحللي في أنابيب 1.5 ملليلتر.
باستخدام كتلة حرارية ، قم بتسخين جميع الأنابيب إلى 100 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة. قم بإزالة الأنابيب من كتلة الحرارة وأجهزة الطرد المركزي عند 14،500 جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لحبيبات أي مكونات غير قابلة للذوبان. تحضير جهاز الكهربائي مع هلام بولي أكريلاميد 12 ٪ مع 10 آبار.
املأ جهاز الرحلان الكهربائي بمخزن مؤقت للتشغيل وقم بإزالة مشط الهلام. ثم سخني العينات على حرارة 100 درجة سلزية لمدة خمس دقائق. أجهزة الطرد المركزي العينات في 14،500 G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة قبل التحميل.
ثم قم بتحميل 30 ميكرولترا من العينة ببطء في كل بئر. استخدم محلول تحلل البروتين والبروتين المضاف أو متجانسة الأنسجة لبقع الكاسباز 1 و 3 و 7 و 8 ، واستخدم محلول تحلل البروتين DN RIPA الموصوف في البروتوكول أو متجانسة الأنسجة للكاسباز 11 و 9. لتقييم جميع caspases الستة في وقت واحد ، استخدم نفس الإجراء لتحميل نفس العينات في كل من المواد الهلامية الستة.
قم بتوصيل جهاز الرحلان الكهربائي بمصدر الطاقة واضبط الطاقة على 80 فولت لمدة 20 دقيقة لبدء تشغيل الهلام. بعد أول 20 دقيقة ، اضبط الطاقة على 100 فولت لمدة 45 إلى 60 دقيقة. مراقبة الجبهة صبغة.
بمجرد وصول مقدمة الصبغة إلى قاع الجل ، قم بإيقاف تشغيل الطاقة. أثناء تشغيل الجل ، قم بإعداد المخزن المؤقت للنقل كما هو موضح في المخطوطة. اجعل الحل جديدا في كل مرة.
قم بإزالة الجل من جهاز الرحلان الكهربائي باستخدام محرر الجل. لإعداد مكدس النقل للهلام ، قم بتنشيط غشاء PVDF عن طريق نقعه في الميثانول لمدة دقيقة واحدة. بلل قطعتين من ورق الترشيح والهلام وغشاء PVDF وانقل المخزن المؤقت لمدة خمس دقائق.
احتفظ بغشاء PVDF والهلام في حاويات منفصلة خلال هذه الحضانة التي تستغرق خمس دقائق. ابدأ في تجميع مكدس النقل على النظام شبه الجاف. على الجانب السفلي من البلاتين نانو ، ضع قطعة واحدة من ورق الترشيح ، وغشاء PVDF ، والهلام ، وأخيرا قطعة واحدة من ورق الترشيح.
قم بتدوير فقاعات الهواء برفق أو الضغط عليها بين الطبقات وأغلق الجزء العلوي من النظام. الآن ، اتصل بمصدر الطاقة. اضبط الطاقة على 25 فولت لمدة 40 دقيقة.
بعد النقل ، قم بتفكيك مكدس النقل ، وجمع الغشاء ، ووضعه في طبق بتري مربع. بعد ذلك ، قم بإجراء حجب الغشاء عن طريق إضافة 15 ملليلتر من محلول الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ واحتضان الغشاء على شاكر هزاز عند 50 إلى 70 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الحجب ، وأضف 10 ملليلتر من محلول الأجسام المضادة المخفف ، واحتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو أربع درجات مئوية طوال الليل على شاكر هزاز ، كما هو موضح سابقا.
بعد ذلك ، اجمع محلول الأجسام المضادة واغسل الغشاء بإضافة 15 مل من TBST إلى الغشاء على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تجاهل TBST. كرر الغسيل مع 15 ملليلتر من TBST ثلاث مرات.
أضف 10 ملليلتر من محلول الأجسام المضادة المترافق HRP الثانوي المخفف. احتضان على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، بمجرد إزالة محلول الأجسام المضادة ، اغسل الغشاء بإضافة 15 مل من TBST على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
بعد الانتهاء من خطوات الغسيل وإزالة TBST ، أضف 10 ملليلتر من ركيزة HRP عالية الحساسية. اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. إزالة الغشاء من الركيزة.
انتقل مباشرة إلى التصوير باستخدام جهاز تصوير التلألؤ الكيميائي مع إدخال درج الترانس الأبيض الملحق في الموضع السفلي. فضح الغشاء باستخدام وضع التعرض التلقائي. يتم تحليل الكاسباز المؤيد والمنشط 1 و 11 و 3 و 7 و 8 و 9 في النوع البري وطفرة ZBP1 بعد عدوى فيروس الأنفلونزا A ، والنوع البري و AIM2 المتحور بعد عدوى HSV1 ، وعدوى Francisella novicida ، أو النوع البري و NLRP3 المتحور BDMs بعد تحفيز عديد السكاريد الدهني وتحفيز ATP.
لا تخضع الخلايا التي تفتقر إلى مستشعرات PANoptosis الأولية لموت الخلايا القوي استجابة للمحفزات المشابهة ل PANoptosis. تؤدي عدوى فيروس الأنفلونزا A إلى تكوين ZBP1-PANoptosome ويتم حماية الخلايا الناقصة ZBP1 بشكل كبير من موت الخلايا أثناء عدوى فيروس الأنفلونزا A. وبالمثل ، فإن عدوى HSV1 و Francisella novicida تحفز تكوين AIM2 PANoptosome ، وتفشل الخلايا الناقصة AIM2 في الخضوع لموت الخلايا القوي استجابة لهذه العدوى.
تتم حماية الخلايا التي تفتقر إلى أجهزة الاستشعار الالتهابية في المنبع من موت الخلايا استجابة للمحفزات الخاصة بها ، ولا تخضع الخلايا الناقصة NLRP3 لموت الخلايا استجابة لعديد السكاريد الدهني و ATP. من المهم أن تتذكر تحضير خليط من كل من محللات الخلايا لتحديد كاسباز معين. بعد تحميل النفاثة ، يجب تخزين العينة المضيئة ناقص 20 درجة للحفاظ على سلامة أهداف الكاسباز للمتابعة بالاقتران مع هذا البروتوكول ، يمكن استخدام تصوير موت الخلايا في الوقت الفعلي أو مقايسات LDH لمراقبة تنفيذ موت الخلايا ، ويمكن استخدام ELIZAs للتحقق من إطلاق السيتوكينات أو DAMPs من الخلايا التي تمر بأنواع مختلفة من موت الخلايا.
