خلل التنظيم redox إشارات متورطة في التسبب في الأمراض المتنوعة. تتطلب دراسة بيولوجيا الأكسدة الحمراء الكشف الدقيق لأنواع الأكسجين التفاعلية في مختلف المقصورات الخلوية والأنسجة. التحليل الطيفي EPR هو الطريقة الوحيدة التي تقيس الجذور الحرة بشكل لا لبس فيه.
ويبين هذا البروتوكول طريقة عملية لمعالجة وتخزين العينات البيولوجية من أجل التحليل الطيفي لـ EPR. وتوضح هذه البروتوكولات استخدام مسباري EPR و spin في نموذجين تمثيليين. على الرغم من أنها يمكن تكييفها لتقييم الأنواع النشطة في بيئات بيولوجية أخرى.
تصميم التجربة والتعامل مع العينة أمران حاسمان لقابليتها في التكاثر. نوصي بالنظر في كثافة الخلايا وضمان ضوابط مناسبة مطابقة للوقت. تبدأ برفق غسل الخام 264.7 الخلايا مع ملليلتر واحد من كريبس Henseleit العازلة أو KHB، في بئر.
وعلاج الخلايا مع 500 ميكرولتر من KHB، تستكمل مع 100 ميكروميل من DTPA في بئر. للمعالجة المسبقة مع dismutase أكسيد فائق، إضافة 15 ميكرولترات من مخزون dismutase فائقة أكسيد، أو مركبة، إلى كل بئر، ووضع لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في نهاية المعالجة المسبقة للـ superoxide dismutase، إضافة 12.5 ميكرولترات من 10 ملليمتر CMH و 40 ميكرولترات من 125 مجهرية PMA حل العمل إلى الآبار المناسبة، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة.
ضع اللوحات على الجليد على الفور وجمع المخزن المؤقت من كل بئر إلى أنابيب 1.5 ملليلتر فردية على الجليد. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولترات من KHB الطازجة بالإضافة إلى DTPA إلى كل بئر وكشط الخلايا بلطف من أسفل كل بئر. ثم إعادة تعليق الخلية مع الأنابيب ونقل الخلايا إلى أنابيب 1.5 ملليلتر الفردية على الجليد.
للكشف عن أكسيد فائق في درجة حرارة الغرفة، أولا تحميل 50 ميكرولترات من عينة واحدة العازلة أو خلية في أنبوب شعري وختم الأنبوب. ضع الأنبوب على الفور في الرنين البارامغناطيسي للإلكترون، أو EPR، مطياف وقم بتعيين معلمات الاستحواذ على EPR لقياسات درجة حرارة الغرفة. اختبار دائماً عينة فارغة من المخزن المؤقت تحتوي على نفس تركيز مسبار تعامل في ظل نفس الظروف التجريبية كتحكم.
للكشف عن أكسيد فائق في 77 درجة كلفن، تحميل 150 ميكرولترات من عينة واحدة في قطعة بوصة واحد إلى اثنين من اثيلين البوليتيترافلورو على التوالي، أو PTFE، أنابيب، مع سدادة مطاطية في نهاية واحدة. ختم الطرف الآخر من الأنبوب مع سدادة ثانية وفلاش تجميد العينة في النيتروجين السائل. ثم قم بإزالة سدادات بسرعة ووضع أنابيب PTFE في أنبوب التبريد المسمى لتخزين النيتروجين السائل.
بالنسبة إلى قياسات EPR، املأ الاصبع الهفوة من مطياف EPR بالنيتروجين السائل ووضع أنابيب PTFE التي تحتوي على العينة في النيتروجين السائل. ضع الاصبع في مطياف EPR وقم بتعيين معلمات الاستحواذ على EPR للقياسات عند 77 درجة كلفن. للكشف عن ROS في أنسجة الرئة المجمدة، ضع الأنسجة على الجليد الجاف واستخدم الملاقط لتثبيت الأنسجة المجمدة على الجليد الجاف.
قطع العينة إلى خمس قطع مليغرام 15، وتزن القطع في أنبوب 1.5 ملليلتر tared. إضافة 196 ميكرولترات من KHB بالإضافة إلى DTPA وأربعة microliters من CMH إلى العينة، واحتضان عينة الرئة لمدة ساعة واحدة في حمام الماء 37 درجة مئوية قبل تعبئة شظايا الأنسجة مع الطرد المركزي وجيزة. ثم ضع العينة على الجليد قبل نقل 150 ميكرولترات من المابير إلى قطعة من أنابيب PTFE لتجميد فلاش استعدادا لقياس EPR كما أظهرت للتو.
تقييم إجمالي إنتاج أكسيد فائق في الخام 264.7 الخلايا حفزت مع PMA كما هو موضح، ويكشف أن تركيز النيتريكسيد في كل من تعليق الخلية والعزلة من الخلايا المعالجة PMA مماثلة، وذلك بسبب الطبيعة نفاذية وسرعة التوازن في التحقيق تدور. وذريكا النيتريكسيد الزيادات في إشارة الخلايا الخام 264.7 حفزت مع PMA، بالمقارنة مع الخلايا التحكم، ولكن ليس في الخلايا قبل المعالجة مع الخلايا منيعة سوبر أكسيد dismutase. كما أن تركيز النيتريكسيد الذي تم الحصول عليه في درجات حرارة منخفضة في الخلايا الخام 264.7 بعد التحفيز مع PMA هو أيضاً مخفف في وجود ديسموتيز أكسيد فائق يتفق مع بيانات درجة حرارة الغرفة.
يتم زيادة تركيز النيتريكسيد في الدم والسوائل القصبات من الفئران البليو والفئران المعالجة، وكذلك داخل supernatants من قطع أنسجة الرئة المحاجزة من الفئران البليلو والحيوانات المصابة، مقارنة بالضوابط التي يعاملها برنامج تلفزيوني. وعلاوة على ذلك، بعد حقن مسبار الدوران المداري الرجعي، تظهر فئران بيلو والحيوانات المعالجة إشارة تحقيق دوران أعلى مقارنة بالضوابط. وستتيح هذه البروتوكولات العملية للباحثين اختبار إنتاج الجذور الحرة في مقصورات خلوية مختلفة وعينات بيولوجية من قبل EPR، بما في ذلك قياسات درجات الحرارة المنخفضة.
