調節不全酸化還元シグナル伝達は、多様な疾患の病因に関係する。レドックス生物学の研究では、異なる細胞および組織コンパートメントにおける活性酸素種の正確な検出が必要です。EPR分光法は、フリーラジカルを明確に測定する唯一の方法です。
このプロトコルは、EPR分光法用の生物学的サンプルの取り扱いと保存のための実用的な方法を示す。これらのプロトコルは、2つの代表的なモデルにおけるEPRおよびスピンプローブの使用を示す。それらは他の生物的な設定で活性種を評価するように適合することができるが。
実験の設計とサンプルの取り扱いは、再現性にとって重要です。セル密度を考慮し、適切な時間に一致するコントロールを確保することをお勧めします。生の264.7細胞を1ミリリットルのクレブス-ヘンセリートバッファーまたはKHBで穏やかに洗浄します。
そして、KHBの500マイクロリットルで細胞を治療し、1ウェルあたり100マイクロミルのDTPAを補う。スーパーオキシドジスムターゼで退却するには、各ウェルに15マイクロリットルのスーパーオキシドジスムターゼストック(車両)を加え、プレートを摂氏37度で10分間置きます。スーパーオキシドジスムターゼ前処理の最後に、10ミリモルCMHの12.5マイクロリットルと125マイクロモルPMAの40マイクロモルPMA作業溶液を適切な井戸に加え、摂氏37度で50分間インキュベートします。
すぐに氷の上にプレートを置き、氷の上の個々の1.5ミリリットルのチューブに各井戸から緩衝液を収集します。次に、新鮮なKHBとDTPAを100マイクロリットルずつ各ウェルに加え、各ウェルの底から細胞を静かに削ります。その後、ピペット処理で細胞懸濁液を再懸濁し、細胞を氷上の個々の1.5ミリリットルチューブに移します。
室温でのスーパーオキシド検出のために、最初に1つのバッファーまたはセルサンプルの50マイクロリットルをキャピラリーチューブにロードし、チューブを密封します。直ちにチューブを電子常磁性共鳴(EPR、分光計)に入れ、室温測定用のEPR取得パラメータを設定します。常にコントロールと同じ実験条件下で処理されたプローブの同じ濃度を含むバッファのブランクサンプルをテストする。
77度ケルビンでのスーパーオキシド検出の場合、1つのサンプルの150マイクロリットルをストレートポリテトラフルオロエチレン(PTFE、チューブ)の1~2インチにロードし、一端にゴム栓を付けます。チューブのもう一方の端を第2のストッパーで密封し、液体窒素でサンプルをフラッシュフリーズします。その後、すぐにストッパーを取り外し、液体窒素貯蔵のためにラベル付けされたクライオチューブにPTFEチューブを置きます。
EPR測定の場合、EPR分光計の指デュワーを液体窒素で満たし、サンプルを含むPTFEチューブを液体窒素に入れる。EPR 分光計に指デュワーを配置し、77 度ケルビンで測定のための EPR 取得パラメーターを設定します。凍結肺組織のROS検出のために、乾燥した氷の上に組織を置き、ピンセットを使用してドライアイス上のフラッシュ凍結組織を安定させます。
サンプルを5つの15ミリグラムに切り、タール1.5ミリリットルチューブで部分の重量を量ります。196マイクロリットルのKHBとDTPAと4マイクロリットルのCMHをサンプルに加え、肺サンプルを37°Cの水浴で1時間インキュベートしてから、組織断片を短い遠心分離でペレット化します。次に、サンプルを氷の上に置いてから、150マイクロリットルの上清をPTFEチューブに移してフラッシュ凍結します。
PMAで刺激された生264.7細胞における全スーパーオキシド産生の評価が実証されるように、PMA処理細胞の細胞懸濁液および緩衝液の両方における亜酸化窒素濃度が類似していることを明らかにし、その結果、スピンプローブの透過性と迅速な平衡化が可能である。この第二酸化窒素ラジカルシグナルは、PMAで刺激された生の264.7細胞ではシグナルが増加し、対照細胞と比較して、細胞不透過性のスーパーオキシドジスムターゼで前処理された細胞では増加しない。PMAによる刺激後の生の264.7細胞で低温で得られた亜酸化窒素の濃度も、室温データと一致するスーパーオキシドジスムターゼの存在下で減衰する。
第二四酸化窒素濃度は、PBS治療対照と比較して、BLEoマウスおよび治療されたマウスの血液および気管支肺胞洗浄液および、ブリーマウスおよび負傷した動物から採取された肺組織片の上清内で増加する。また、レトロ軌道スピンプローブ注入後、bleoマウスおよび処置動物は、コントロールに比べてより高いスピンプローブ信号を示す。これらの実用的なプロトコルは、研究者が低温測定を含むEPRによって異なる細胞コンパートメントおよび生物学的サンプルでのフリーラジカル産生をテストすることを可能にする。
