Дисрегулируемая красная сигнализация вовлечена в патогенез различных заболеваний. Изучение биологии редокса требует точного обнаружения реактивных видов кислорода в различных клеточных и тканевых отсеках. Спектроскопия EPR является единственным методом, который измеряет свободные радикалы однозначно.
Этот протокол демонстрирует практический метод обработки и хранения биологических образцов для спектроскопии ЭПР. Эти протоколы иллюстрируют использование EPR и спин-зондов в двух репрезентативных моделях. Хотя они могут быть адаптированы для оценки активных видов в других биологических условиях.
Конструкция эксперимента и обработка образца имеют решающее значение для его воспроизводимости. Мы рекомендуем учитывать плотность клеток и обеспечивать надлежащие элементы управления, соответствующие времени. Начните с мягкого мытья сырых 264,7 клеток с одним миллилитров Кребс-Хенселейт буфер или KHB, на колодец.
И лечить клетки с 500 микролитров KHB, дополненный 100 микромил DTPA на колодец. Чтобы предварительно обработать супероксиддисмутазой, добавьте 15 микролитров бульона супероксиддисмутазы, или транспортного средства, к каждой хорошо, и поместите пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут. В конце предварительной обработки супероксиддисмутазы добавьте 12,5 микролитров 10 миллимоляров CMH и 40 микролитров 125 микромоляров PMA рабочего раствора к соответствующим скважинам и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 50 минут.
Немедленно поместите пластины на лед и соберите буфер из каждого колодец в отдельные 1,5 миллилитровые трубки на льду. Затем добавьте 100 микролитров свежего KHB плюс DTPA к каждому колодец и аккуратно соскреблите клетки со дна каждой хорошо. Затем повторное использование клеточных суспензий с пипетками и передача клеток в отдельные 1,5 миллилитровые трубки на льду.
Для обнаружения супероксида при комнатной температуре сначала загрузите 50 микролитров одного буфера или образца клетки в капиллярную трубку и запечатайте трубку. Немедленно поместите трубку в электронный парамагнитный резонанс, или спектрометр EPR, и установите параметры приобретения EPR для измерения комнатной температуры. Всегда проверьте пустой образец буфера, содержащий ту же концентрацию зонда, обработанного в тех же экспериментальных условиях, что и контроль.
Для обнаружения супероксида при 77 градусах Кельвина загрузите 150 микролитров одного образца в кусок прямого полиэтилена размером от одного до двух дюймов, или PTFE, трубки, с резиновой пробкой на одном конце. Печать другой конец трубки со второй пробкой и вспышки заморозить образец в жидком азоте. Затем быстро удалите пробки и поместите трубки PTFE в помеченную криотрубку для хранения жидкого азота.
Для измерений ЭПР заполните двойку пальца спектрометра EPR жидким азотом и поместите трубки PTFE, содержащие образец в жидком азоте. Поместите двойку пальца в спектрометр EPR и установите параметры приобретения EPR для измерений на 77 градусов Кельвина. Для обнаружения ROS в замороженных тканях легких поместите ткань на сухой лед и используйте пинцет для стабилизации флэш-замороженной ткани на сухом льду.
Разрежьте образец на пять 15 миллиграммов кусочки и взвесьте кусочки в смоляной трубке весом 1,5 миллилитров. Добавьте 196 микролитров KHB плюс DTPA и четыре микролитера CMH в образец, и инкубировать образец легких в течение одного часа в 37 градусов по Цельсию водяной бане, прежде чем гранулировать фрагменты ткани с краткой центрифугации. Затем поместите образец на лед перед передачей 150 микролитров супернатанта в кусок трубки PTFE для флэш-замораживания при подготовке измерения EPR, как только что продемонстрировано.
Оценка общего производства супероксида в необработанных 264,7 клеток, стимулируемых ПМА, как было продемонстрировано, показывает, что концентрация нитроксида как в клеточной суспензии, так и в буфере обработанных ПМА клеток аналогична, благодаря проницаемому характеру и быстрой эквилибрации спинового зонда. Нитроксидные радикалы сигнал увеличивается в сырых 264,7 клеток стимулируется с ПМА, по сравнению с контрольными клетками, но не в клетках, предварительно обработанных клеточной непроницаемой супероксид дисмутазы. Концентрация нитроксида, полученного при низких температурах в сырых 264,7 клетках после стимуляции с помощью ПМА, также затухается при наличии дисмутазы супероксида в соответствии с данными комнатной температуры.
Концентрация нитроксида увеличивается в крови и бронхоальвеолярной жидкости лаважа мышей блео и обработанных мышей, а также в супернатантах собранных частей легочной ткани от мышей блео и раненых животных, по сравнению с обработанными PBS контролем. Кроме того, после инъекции ретро-орбитального спина зонда, bleo мышей и обработанных животных демонстрируют более высокий сигнал зонд спина по сравнению с управления. Эти практические протоколы позволят исследователям протестировать свободное радикальное производство в различных клеточных отсеках и биологические образцы ЭПР, включая измерения низкой температуры.
