A sinalização de redox disregulada está implicada na patogênese de diversas doenças. O estudo da biologia redox requer a detecção precisa de espécies reativas de oxigênio em diferentes compartimentos celulares e tecidos. A espectroscopia de EPR é o único método que mede os radicais livres de forma inequívoca.
Este protocolo demonstra um método prático de manuseio e armazenamento de amostras biológicas para espectroscopia de EPR. Estes protocolos ilustram o uso de sondas EPR e spin em dois modelos representativos. Embora possam ser adaptados para avaliar as espécies ativas em outros ambientes biológicos.
O desenho do experimento e o manuseio da amostra são fundamentais para sua reprodutibilidade. Recomendamos considerar a densidade celular e garantir controles adequados para o tempo. Comece lavando suavemente células cruas 264,7 com um mililitro de Krebs-Henseleit Buffer ou KHB, por bem.
E trate as células com 500 microliters de KHB, suplementadas com 100 micromil de DTPA por poço. Para pré-tratamento com dismutase de superóxido, adicione 15 microliters de material de desmutase de superóxido, ou veículo, a cada poço, e coloque a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos. No final do pré-tratamento de dismutase de superóxido, adicione 12,5 microliters de 10 mililitros CMH e 40 microliters de 125 micromolares pma solução de trabalho para os poços apropriados, e incubar a 37 graus Celsius por 50 minutos.
Coloque imediatamente as placas no gelo e colete o tampão de cada poço em tubos individuais de 1,5 mililitro no gelo. Em seguida, adicione 100 microliters de KHB fresco mais DTPA a cada poço e raspe suavemente as células da parte inferior de cada poço. Em seguida, resuspenco as suspensões celulares com tubulação e transfira as células para tubos individuais de 1,5 mililitro no gelo.
Para detecção de superóxido à temperatura ambiente, primeiro carregue 50 microlitadores de um tampão ou amostra celular em um tubo capilar e selado o tubo. Coloque imediatamente o tubo na ressonância paramagnética eletrônica, ou EPR, espectrômetro e defina os parâmetros de aquisição de EPR para medições de temperatura ambiente. Teste sempre uma amostra em branco de tampão contendo a mesma concentração de sonda tratada sob as mesmas condições experimentais de um controle.
Para detecção de superóxido a 77 graus Kelvin, carregue 150 microliters de uma amostra em um pedaço de politetrafluoroetileno reto, ou PTFE, tubo, com uma rolha de borracha em uma extremidade. Sele a outra extremidade do tubo com uma segunda rolha e o flash congele a amostra em nitrogênio líquido. Em seguida, remova rapidamente as rolhas e coloque a tubulação PTFE em um crioboto rotulado para armazenamento de nitrogênio líquido.
Para medições de EPR, encha a de guerra do espectrômetro EPR com nitrogênio líquido e coloque a tubulação PTFE contendo a amostra no nitrogênio líquido. Coloque o dedo deguerr o espectrômetro EPR e ajuste os parâmetros de aquisição do EPR para medições a 77 graus Kelvin. Para detecção de ROS em tecido pulmonar congelado, coloque o tecido em gelo seco e use pinças para estabilizar o tecido congelado em gelo seco.
Corte a amostra em cinco pedaços de 15 miligramas, e pese os pedaços em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 196 microliters de KHB mais DTPA e quatro microliters de CMH à amostra, e incubar a amostra pulmonar por uma hora em um banho de água de 37 graus Celsius antes de pelleting os fragmentos de tecido com uma breve centrifugação. Em seguida, coloque a amostra no gelo antes de transferir 150 microlitadores do supernante em um pedaço de tubo PTFE para congelamento de flash na preparação da medição de EPR como apenas demonstrado.
A avaliação da produção total de superóxido em células brutas 264,7 estimuladas com PMA como demonstrado, revela que a concentração de nitroxídeo tanto na suspensão celular quanto no tampão das células tratadas com PMA é semelhante, devido à natureza permeável e ao rápido equilíbrio da sonda spin. O sinal de radical nitroxide aumenta em células brutas 264,7 estimuladas com PMA, em comparação com células de controle, mas não em células pré-tratadas com desmutase de superóxido impermeável por células. A concentração de nitroxídio obtida a baixas temperaturas em células brutas de 264,7 após a estimulação com PMA também é atenuada na presença de dismutase de superóxido consistente com os dados de temperatura ambiente.
A concentração de nitroxídeo é aumentada no sangue e no fluido de lavagem broncoalveolar de camundongos bleo e camundongos tratados, bem como dentro dos supernaciantes de pedaços de tecido pulmonar colhido de camundongos bleo e animais feridos, em comparação com os controles tratados com PBS. Além disso, após a injeção de sonda de spin retro-orbital, camundongos bleo e animais tratados demonstram um sinal de sonda de giro mais alto em comparação com os controles. Esses protocolos práticos permitirão que os pesquisadores testem a produção radical livre em diferentes compartimentos celulares e amostras biológicas por EPR, incluindo medições de baixa temperatura.
