إعادة برمجة النسب المباشر من الخلايا الليفية إلى خلايا السلفة الاريثيرويدية. انها طريقة جديدة قمنا بتطويرها في مختبرنا من أجل دراسة أفضل لعمليات التنظيم النسخي تحديد مصير الخلايا الاريثرويد. الميزة الرئيسية مع استخدام إعادة برمجة النسب المباشر لدراسة التنمية هو أنه تقنية واضحة جدا.
لذلك بالمقارنة مع، على سبيل المثال، فقدان دراسات الدالة داخل الفئران خروج المغلوب، وهنا يمكننا بسهولة جدا التعامل مع عامل، الإفراط في التعبير عنه في نقطة زمنية معينة، ومن ثم الحصول بسهولة على ما يكفي من المواد لدراسة آثار المصب مثل التعديلات الكروماتين أو التغيرات التعبير الجيني. في حين أن هذه الطريقة تركز على إعادة برمجة الخلايا الليفية ذيل طرف الماوس إلى النسل erythroid، ويمكن أيضا أن تطبق على أنواع الخلايا الليفية الأخرى، وعلى الكائنات الحية الأخرى بما في ذلك البشر. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو نقل الدم في أنه يمهد الطريق نحو إنتاج خلايا الدم الحمراء في المختبر.
إثبات الإجراء سيكون (ألبان يوهانسون) من مجموعتي البحثية تبدأ من خلال تغطية سطح الأطباق مع 0.1٪ الجيلاتين. احتضانهم في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا.
التعرق الحل الجيلاتين والسماح للأطباق لتجف. استخدام مقص لقطع في قاعدة ذيل الماوس القتل الرحيم لإزالته. ضع الذيل في DPBS مع 2٪ FBS حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
في غطاء لثقافة الأنسجة في ظروف معقمة ، أعد محلول التربسين المخفف بنسبة 0.02٪ التربسين EDTA في DPBS وأضف 5 ملليلترات في طبق غير مصقول طوله 10 سنتيمترات. في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة، وغسل الذيل في ما يكفي من الإيثانول 70٪في أنبوب 15 ملليلتر لتغطية ذلك ومن ثم في DPBS. وضع شقة الذيل في طبق واستخدام ملقط لعقد ذلك في مكانه.
استخدام مشرط لإجراء شق على الذيل على طول محور طولي من القاعدة إلى الطرف. استخدام زوج من ملقط لفهم الذيل وعقد عموديا واستخدام الزوج الثاني لقبضة الجلد بجانب شق في قاعدة الذيل وقشر مرة أخرى. قم بإجراء هذا على جانبي الشق حتى يمكن تقشير الجلد عن طريق السحب إلى الأسفل نحو طرف الذيل.
عقد ذيل مقشر مع ملقط على الطبق التي تحتوي على حل التربسين. استخدام مقص تشريح لقطع الذيل إلى قطع صغيرة. استخدام مقص لتفتيت هذه القطع في حل التربسين إلى قطع أصغر حجما ثم احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
لإخماد التربسين، إضافة مجلدين من FEX المتوسطة، DMEM مع المكملات الغذائية والمضادات الحيوية. جمع محتويات كاملة من الطبق في أنبوب 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 350 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
تعرق و resuspend بيليه التي تحتوي على شظايا الذيل في 10 ملليلتر من FEX المتوسطة الطازجة. نقل هذا التعليق إلى طبق مغلفة الجيلاتين. احتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 4٪ الأكسجين، إضافة الطازجة FEX المتوسطة كل يومين.
مراقبة الثقافة بعد خمسة إلى سبعة أيام، والتي قد تعلق شظايا الذيل في الجزء السفلي من الطبق، والالخلايا الليفية تتحرك بعيدا عنهم. مرة واحدة مجموعات من الخلايا الليفية مرئية، يهز بلطف الطبق لطرد القطع الذيل. استلهم الوسط مع جميع شظايا العظام ، وترك الخلايا الليفية تعلق على لوحة.
إضافة 10 ملليلتر من FEX المتوسطة الطازجة والثقافة الخلايا الليفية حتى التقاء. لضمان عدم وجود تلوث من قبل البروتينات الارتباطية في ثقافة الخلايا الليفية، افصل الخلايا عن الصفيحة باستخدام التربسين EDTA كما هو موضح في المخطوطة. إضافة المتوسطة وجمع الخلايا، وإضافة الخرز المغناطيسي مع الأجسام المضادة.
استخدام نظام فصل مغناطيسي لإزالة الخلايا التي تعبر عن علامات الدم. إن تضمين هذه الخطوة أمر حيوي للغاية لأنها تقضي على أي مراكز الممارسات المنسقة التي قد تكون موجودة في الثقافة وبالتالي احتمال وجود أي إيجابيات كاذبة في يوم تحليل FACS. بذور خلايا التعبئة والتغليف الفيروسية في حوالي 25،000 خلية لكل سنتيمتر مربع على طبق معالجة ثقافة الأنسجة.
احتضان الخلايا في DMEM عالية الجلوكوز في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، قم بإزالة الوسيطة وإضافة نصف الحجم المستخدم لثقافة بين عشية وضحاها من DMEM مع عدم وجود إضافات. في فترة ما بعد الظهر، تحقق من الخلايا ل 70 إلى 80٪ التقاء اللازمة لtransfefection.
ابدأ عملية النقل عن طريق إعداد خليط من اثنين إلى واحد من ستة ميكروغرامات من متجه التعبير PMX وثلاثة ميكروغرامات من متجه المساعد الذي يحتوي على Gag و Pol ومغلف للجينات لكل عامل إعادة برمجة. بعد ذلك ، لكل عامل إعادة برمجة ، أضف 300 ميكرولترات من DMEM درجة حرارة الغرفة في أنبوب البوليسترين العقيم. ثم قم بإضافة 27 ميكرولترات بعناية من كاشف النقل التجاري في درجة حرارة الغرفة مباشرة إلى الوسط لتجنب الاتصال بجدار الأنبوب.
أضف مزيج البلازميد إلى كاشف نقل يحتوي على أنبوب. دوامة لفترة وجيزة واحتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. دوامة مُكْوّدَةُ الـ DNA مجدداً.
إضافته دروبا إلى خلايا التعبئة والتغليف الرجعية بحيث يتم توزيعها بالتساوي على الثقافة واحتضان في 37 درجة مئوية. 24 ساعة بعد transfection، وإزالة المتوسطة وإضافة DMEM مع 20٪ FBS و 100 وحدة لكل ملليلتر البنسلين الستريبتوميسين. بعد 48 ساعة من عملية الانتراق، اجمع المُندفع وتصفية ذلك من خلال مُرشاح مُحقن بحجم مُيكرومتر 0.22.
بدء عملية النقل عن طريق البذر الذيل تلميح الخلايا الليفية في 10، 000 الخلايا لكل سنتيمتر مربع على 0.1٪ الجيلاتين قبل المغلفة الأطباق في FEX المتوسطة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. وعند تنفيذ هذه الخطوة، من المهم إضافة الأربعة من كبرى الفيروسات الرجعية بنسبة متساوية لضمان أن تسهم جميع المواد المتحولة الأربع على قدم المساواة في عملية إعادة البرمجة.
في اليوم التالي، أعد خليط تحويلي عن طريق إضافة أول حجم واحد من الفيروسية فائقة لكل عامل إعادة برمجة تكملها أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر من مُكشف عدوى الفيروسات الرجعية إلى ستة مجلدات من FEX المتوسطة. بعد ذلك، التعرق المتوسطة FEX من ثقافة الخلايا الليفية وإضافة خليط transduction. احتضان تفاعل النقل لمدة أربع ساعات في 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 4٪ الأكسجين.
بعد أربع ساعات، يُطرّح خليط النقل وأضف طازجًا من إعادة البرمجة. احتضان في 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجة لمدة ثمانية أيام، مضيفا جديدة إعادة برمجة المتوسطة كل يومين. مراقبة إعادة برمجة ناجحة مع الكتل المنتجة من الخلايا المنفصلة عن اللوحة.
لحصاد الخلايا المبرمجة من الطبق لمزيد من التحليل، ماص بلطف لهم صعودا وهبوطا ومن ثم جمع الخلايا. بعد إعادة برمجة ناجحة من iEPs، الخلايا الإيجابية YFP يمكن ملاحظتها في وقت مبكر قبل خمسة أيام بعد عملية النقل. تصبح مستديرة، وترفع من سطح اللوحة، وتبدأ في تشكيل مجموعات، وتعرض مورفولوجيا السلائف الشبيهة بالجرثرويد.
الهيموغلوبينية لبعض الخلايا واضح من خلال تلطيخ البنزيدين الإيجابي. ويعبر جزء صغير عن علامة السطح الخاصة بالريثيرويد TER-119. وفي اليوم الثامن، يمكن رؤية مجموعات كبيرة إيجابية من YFP.
اليوم الثامن iEPs لديها أكثر تميزا النمط الظاهري من iEPs اليوم الخامس. فهي أصغر بكثير، وقد تراكمت أكثر الهيموغلوبين، وتظهر زيادة التعبير عن TER-119. تحليل التعبير الجيني من قبل qPCR من iEPs التي تم جمعها في اليوم الثامن يظهر أنها قد أغلقت تقريبا التعبير عن الجينات الليفية و upregulated العديد من الجينات الإريثرويد.
بعد إجراء مقايسات تشكيل مستعمرة BFU-e على الخلايا التي أعيد برمجتها، تشكل iEPs اليوم الثامن نوعين من المستعمرات، حمراء بشكل واضح وليست حمراء بشكل واضح. في حين أن الخلايا من المستعمرات الحمراء عرض مورفولوجيا اريثروبابلاست، لم خلايا من المستعمرات غير الحمراء. تقريبا واحدة في 1, 000 يوم خمسة شكّل مستعمرات حمراء بينما فقط تقريبا واحدة في 10,000 مستعمرات يشكّل من يوم ثمانية iEPs.
وتتأثر كفاءة إعادة برمجة من الذيل طرف في الخلايا الليفية أو TTFs من رقم مرور. وأظهرت صناديق TTFs التي تم تمريرها تسع مرات انخفاضًا كبيرًا في القدرة على إنتاج مجموعات من الفئات IEPs مقارنة بالخلايا التي تم تمريرها ثلاث مرات. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر ظروف الثقافة المختلفة على كفاءة إعادة البرمجة.
12- وتُزرع في نورموكسيا في 10 أيام أبطأ بكثير في إعادة البرمجة، كما أن مجموعات IEP تُلاحظ بعد 10 أيام بدلاً من خمسة إلى ثمانية أيام. بعد هذا الإجراء، يمكن تطبيق أساليب مثل مقايسات تشكيل مستعمرة، تحليل qPCR وFACS من أجل تحديد حالة تمايز الخلية. منذ تطورها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الإريثروبويس في فهم التبديل بين الخلايا الإريثرويدية البدائية والنهائية في الماوس والإنسان.
