線維芽細胞からエリスロイド前駆細胞への直接系統リプログラミング。これは、エリスロイド細胞の運命を決定する転写調節のプロセスをよりよく研究するために、私たちの研究室で開発した新しい方法です。直接系統リプログラミングを使用して開発を研究する主な利点は、非常に簡単なテクニックであるということです。
したがって、例えばノックアウトマウス内の機能研究の喪失と比較して、ここでは非常に簡単に因子を操作し、特定の時点でそれを過剰発現させ、クロマチン修飾や遺伝子発現変化などの下流の効果を研究するのに十分な材料を簡単に得ることができます。この方法は、エリスロイド前駆細胞へのマウスの尾先端線維芽細胞の再プログラミングに焦点を当てるが、それはまた、他の線維芽細胞タイプ、およびヒトを含む他の生物に適用することができる。この技術の意味は、輸血医学に向かって広がって、それはインビトロで赤血球の生産に向けて道を開く.
この手順を実証することは、私の研究グループのアルバン・ヨハンソンです。0.1%ゼラチンで皿の表面を覆うことから始めます。摂氏37度で約20分間インキュベートします。
ゼラチン溶液を吸引し、皿を乾燥させます。安楽死させたマウスの尻尾の付け根で切り取って取り除きます。2%FBS の DPBS に尾を置いて、すぐに使用できます。
無菌状態の組織培養フードで、DPBSで0.02%トリプシンEDTAの希釈トリプシン溶液を調製し、コーティングされていない10センチメートル皿に5ミリリットルを加えます。組織培養フードでは、15ミリリットルのチューブで十分な70%エタノールで尾を洗浄し、DPBSで覆います。皿に尻尾を平らに置き、鉗子を使って所定の位置に保持します。
メスを使用して、ベースから先端までの縦軸に沿って尾を切開します。一対の鉗子を使用して尾をつかんで垂直に保持し、2番目のペアを使用して尾部の根元の切開の横の皮膚をつかみ、それを剥がします。皮膚が尾の先端に向かって下方に引っ張ることによって剥がれるまで、切開の両側でこれを行います。
トリプシン溶液を含む皿の上に鉗子で皮をむいた尾を保持します。解剖はさみを使用して尾を小さく切ります。はさみを使用してトリプシン溶液中のこれらの部分をさらに小さく断片化し、摂氏37度で10分間インキュベートします。
トリプシンをクエンチするには、サプリメントと抗生物質とFEX培地、DMEMの2つのボリュームを追加します。50ミリリットルのチューブに皿の内容物全体を収集します。チューブを摂氏4度で5分間350倍Gで遠心分離する。
上清を吸引し、新鮮なFEX培地の10ミリリットルに尾片を含むペレットを再懸濁する。この懸濁液をゼラチンコーティングされた皿に移します。5%の二酸化炭素と4%の酸素で摂氏37度でインキュベートし、2日ごとに新鮮なFEX培地を加えます。
5~7日後、尾片が皿の底に付着し、線維芽細胞がそれらから離れて移動している培養を観察します。線維芽細胞のクラスターが見えたら、皿を軽く振って尾片を取り除きます。すべての骨片で培地を吸引し、線維芽細胞をプレートに取り付けたままにする。
新鮮なFEX培地の10ミリリットルを加え、繊維芽細胞をコンフルエントになるまで培養する。線維芽細胞培養における造血前駆物質による汚染がないことを確実にするために、原稿に記載されているようにトリプシンEDTAを用いてプレートから細胞を解離する。培地を加え、細胞を収集し、抗体を用いて磁気ビーズを添加します。
造血マーカーを発現する細胞を除去するために磁気分離システムを使用してください。このステップを含めると、培養に存在する可能性のある HSPCs が排除され、FACS 分析の日に誤検出が発生する可能性がなくなります。レトロウイルス包装細胞を約25,000細胞/平方センチメートルで組織培養処理皿にシードします。
摂氏37度と5%の二酸化炭素で高グルコースDMEMで細胞を一晩インキュベートします。翌朝、培地を取り出し、添加物を含めずに一晩培養するために使用する体積の半分を加えます。午後には、トランスフェクションに必要な70〜80%の合流性について細胞を確認してください。
トランスフェクションを開始するには、発現ベクター PMX の 6 マイクログラムと、各リプログラミングファクターに対して Gag、Pol、およびエンベロープ遺伝子を含むヘルパーベクターの 3 マイクログラムの 2 ~ 1 の混合物を準備します。次に、各リプログラミング因子について、滅菌ポリスチレンチューブに300マイクロリットルの室温DMEMを加えます。その後、慎重にチューブ壁との接触を避けるために、培地に直接室温の商業トランスフェクション試薬の27マイクロリットルを追加します。
プラスミドミックスをチューブを含むトランスフェクション試薬に加えます。渦を短時間、室温で15分間インキュベートする。トランスフェクション試薬DNA混合物を再びボルテックスする。
レトロウイルス包装細胞に滴下して、培養物に均等に広がり、摂氏37度でインキュベートします。トランスフェクションの24時間後、培地を取り出し、20%FBSと1ミリリットルペニシリンストレプトマイシンあたり100単位でDMEMを追加します。トランスフェクションの48時間後、上清を収集し、0.22マイクロメーターの細孔サイズのシリンジフィルターを通してそれをフィルタリングします。
FEX培地で0.1%ゼラチンプレコーティングされた皿に1平方センチメートルあたり10,000細胞で尾先端線維芽細胞を播種することによって、トランスダクションを開始します。摂氏37度で24時間インキュベートします。このステップを実施する際には、4つのレトロウイルス上清を等しい比率で添加し、4つの遺伝子すべてがリプログラミングプロセスに等しく寄与することを保証することが重要です。
翌日、最初にレトロウイルス感染試薬のミリリットル当たり4マイクログラムを6回のFEX培地に添加した各リプログラミング因子に対して1回のウイルス上清を1回加えて、トランスダクション混合物を調製する。その後、FEX培地を線維芽細胞培養物から吸引し、その導入混合物を添加する。5%の二酸化炭素と4%の酸素で低酸素条件で摂氏37度で4時間のトランスダクション反応をインキュベートします。
4時間後、トランスダクション混合物を吸引し、新鮮なリプログラミング培地を加える。低酸素状態で摂氏37度で8日間インキュベートし、2日ごとに新鮮なリプログラミング培地を追加します。プレートから切り離された細胞の導出されたクラスターで、成功したリプログラミングを観察します。
さらなる分析のために皿から再プログラムされた細胞を収穫するには、それらを上下に穏やかにピペットし、細胞を収集します。iEPsのリプログラミングに成功した後、YFP陽性細胞は、伝達後5日で観察可能です。それらは丸くなり、プレートの表面から持ち上がり、クラスターを形成し始め、赤血球前駆体のような形態を示す。
いくつかの細胞のヘモグロビン化は、陽性ベンジジン染色によって明らかである。小さい分率はエリスロイド特異的表面マーカーTER-119を表す。8日目までに、大きなYFP陽性クラスターが見られます。
8日目のiEPsは、5日目のiEPsよりも分化したエリスロイド表現型を有する。それらは有意に小さく、より多くのヘモグロビンを蓄積しており、TER-119の発現の増加を示す。8日目に収集されたiEPsのqPCRによる遺伝子発現解析は、線維芽細胞遺伝子の発現をほぼ遮断し、多くのエリスロイド遺伝子をアップレギュレートしていることを示している。
再プログラムされた細胞にBFU-eコロニー形成アッセイを行った後、8日目のiEPsは、明らかに赤色で目に見えない2種類のコロニーを形成する。赤いコロニーからの細胞は赤血球形態を示したが、非赤コロニーからの細胞は示さなかった。約1,000日目の5つのiEPsの約1つは赤いコロニーを形成し、8日目のiEPsから形成されたコロニーは約10,000コロニーに1つだけでした。
尾先端線維芽細胞またはTTFの再プログラミング効率は、通過数の影響を受ける。9回通過したTTFは、3回通過した細胞と比較して、iEPsのクラスターを産生する能力が劇的に低下したことを示した。さらに、異なる培養条件は、リプログラミングの効率に影響を与える可能性があります。
ノルモキシアで培養されたトランスデューセTTFは再プログラムが非常に遅く、IEPクラスターは5〜8日ではなく10日後に観察される。この手順に従って、コロニー形成アッセイ、qPCRおよびFACS分析などの方法を適用して、細胞分化状態を決定することができる。この技術は、その発展以来、マウスとヒトの原始細胞と決定的なエリスロイド細胞の切り替えを理解する上で、エリスロポエシスの分野の研究者に道を開いています。
