Прямая перепрограммирование линии от фибробластов до эритроидных клеток-предшественников. Это новый метод, который мы разработали в нашей лаборатории, чтобы лучше изучить процессы транскрипционные регуляции, определяющие судьбу эритроидных клеток. Основным преимуществом использования перепрограммирования прямой линии для изучения разработки является то, что это очень простая техника.
Так что по сравнению, например, с потерей функциональных исследований в нокаут мышей, здесь мы можем очень легко манипулировать фактором, чрезмерно выразить его в определенный момент времени, а затем легко получить достаточно материала для изучения вниз по течению эффекты, такие как хроматин изменения или изменения экспрессии генов. Хотя этот метод фокусируется на перепрограммирование мыши хвост кончик фибробластов эритроидных прародителей, он также может быть применен к другим типам фибробластов клеток, а также к другим организмам, включая людей. Последствия этого метода распространяются на переливание медицины в том, что он прокладывает путь к производству красных кровяных телец в пробирке.
Демонстрацией процедуры будет Альбан Иоханссон из моей исследовательской группы. Начните с покрытия поверхности блюд с 0,1% желатина. Инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение примерно 20 минут.
Аспирировать раствор желатина и дать посуде высохнуть. Используйте ножницы, чтобы вырезать в основании хвоста усыпанной мыши, чтобы удалить его. Поместите хвост в DPBS с 2%FBS до готовности к использованию.
В тканевой культуре капюшон в стерильных условиях, подготовить разбавленный трипсин раствор 0,02%трипсина EDTA в DPBS и добавить 5 миллилитров в неокрашенные 10-сантиметровое блюдо. В капюшоне культуры ткани, мыть хвост в достаточно 70% этанола в 15-миллилитровой трубке, чтобы покрыть его, а затем в DPBS. Поместите хвост плоским в блюдо и использовать типсы, чтобы держать его на месте.
Используйте скальпель, чтобы сделать разрез на хвосте вдоль его продольной оси от основания до кончика. Используйте пару типсов, чтобы схватить хвост и держать его вертикально и использовать вторую пару, чтобы схватить кожу рядом с разрезом у основания хвоста и очистить его обратно. Выполните это по обе стороны от разреза, пока кожа может быть очищена, потянув вниз к кончику хвоста.
Держите очищенный хвост типсами над блюдом, содержащим трипсиный раствор. Используйте ножницы для вскрытия, чтобы разрезать хвост на мелкие кусочки. Используйте ножницы, чтобы фрагментировать эти части в растворе трипсина на еще более мелкие кусочки, а затем инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Чтобы утолить трипсин, добавьте два тома FEX среды, DMEM с добавками и антибиотиками. Соберите все содержимое блюда в 50-миллилитровую трубку. Центрифуга трубки при 350 раз G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.
Аспирировать супернатант и повторно израсходовать гранулы, содержащие фрагменты хвоста в 10 миллилитров свежей среды FEX. Перенесите эту суспензию в блюдо с желатиновым покрытием. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа и 4%кислорода, добавляя свежие FEX среды каждые два дня.
Наблюдайте за культурой через пять-семь дней, в течение которых фрагменты хвоста прикрепляются в нижней части блюда, и фибробласты отходят от них. Как только скопления фибробластов видны, осторожно встряхните блюдо, чтобы выбить части хвоста. Аспирировать среду со всеми фрагментами костей, оставляя фибробласты прилагается к пластине.
Добавьте 10 миллилитров свежей среды FEX и культуры фибробластов до слияния. Чтобы убедиться, что в фибробластовой культуре нет загрязнения гематопоэтическими прародителями, отмежевать клетки от пластины с помощью трипсина ЭДТА, как описано в рукописи. Добавить средний и собирать клетки, и добавить магнитные бусины с антителами.
Используйте магнитную систему разделения для удаления клеток, выражаюющих гематопоэтические маркеры. В том числе этот шаг является абсолютно жизненно важным, поскольку он устраняет любые ГФУ, которые могут присутствовать в культуре и, следовательно, вероятность каких-либо ложных срабатываний в день анализа FACS. Семена ретровирусных упаковочных клеток примерно на 25 000 клеток на квадратный сантиметр на ткани культуры лечение блюдо.
Инкубировать клетки в высоко глюкозы DMEM при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в одночасье. На следующее утро, удалить средний и добавить половину объема, используемого для культуры ночь DMEM без добавок. Во второй половине дня проверьте клетки на 70-80% слияние, необходимое для трансфекции.
Начните трансфекцию, подготовив два к одному смеси из шести микрограммов вектора экспрессии PMX и трех микрограммов вектора помощников, содержащего gag, Pol и генов конвертов для каждого фактора перепрограммирования. Далее, для каждого фактора перепрограммирования, добавьте 300 микролитров комнатно-температурного DMEM в стерильную полистироловую трубку. Затем аккуратно добавьте 27 микролитров комнатно-температурного коммерческого трансфектного реагента непосредственно в среду, чтобы избежать контакта со стеной трубки.
Добавьте смесь плазмиды в трансфектический реагент, содержащий трубку. Vortex кратко и инкубировать смесь в течение 15 минут при комнатной температуре. Vortex трансфекции реагент ДНК смеси снова.
Добавьте его dropwise к ретровирусным упаковывая клеткам так, что оно равномерно распределено над культурой и инкубировать на 37 градусах Celsius. Через 24 часа после трансфекции, удалить средний и добавить DMEM с 20%FBS и 100 единиц на миллилитр пенициллина стрептомицин. Через 48 часов после трансфекции соберите супернатант и процберите его через фильтр шприца размером 0,22 микрометра.
Начните трансдукцию путем посева фибробластов кончика хвоста на уровне 10 000 клеток на квадратный сантиметр на 0,1% желатиновых предварительно покрытых блюд в среде FEX. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. При выполнении этого шага важно добавить четыре ретровирусных супернатанта в равном соотношении, чтобы все четыре трансгена в равной степени способствовали процессу перепрограммирования.
На следующий день приготовьте трансдукционную смесь, сначала добавив один том вирусного супернатанта для каждого фактора перепрограммирования, дополненного четырьмя микрограммами на миллилитр ретровирусного инфекционного реагента до шести томов среды FEX. После этого, аспирировать FEX среды из фибробластовой культуры и добавить смесь трансдукции. Инкубировать трансдукционную реакцию в течение четырех часов при 37 градусах Цельсия в гипоксических условиях при 5%углекислом газе и 4%кислороде.
Через четыре часа, аспирировать трансдукционную смесь и добавить свежие перепрограммирования среды. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в гипоксических условиях в течение восьми дней, добавляя свежие перепрограммирования среды каждые два дня. Наблюдайте успешное перепрограммирование с помощью уступаемых скоплений клеток, отделенных от пластины.
Чтобы собрать перепрограммированные клетки из блюда для дальнейшего анализа, аккуратно пипетки их вверх и вниз, а затем собирать клетки. После успешной перепрограммирования IEPs, YFP-положительные клетки наблюдаются уже через пять дней после трансдукции. Они становятся круглыми, поднимаются с поверхности пластины, начинают формировать кластеры и отображают эритроидную прекурсорную морфологию.
Гемоглобинизация некоторых клеток проявляется положительным окрашивание бензидина. Небольшая фракция выражает эритроид-специфический поверхностный маркер TER-119. К восьмому дню можно увидеть большие кластеры YFP-положительных.
День восемь iEPs имеют более дифференцированный фенотип эритроида, чем день пять IEPs. Они значительно меньше, накопили больше гемоглобина и показывают повышенное выражение ТЕР-119. Анализ экспрессии генов, проведенный qPCR IEPs, собранный на восьмой день, показывает, что они почти закрыли экспрессию генов фибробластов и регулируют многие эритроидные гены.
После выполнения BFU-e колонии формирования анализов на перепрограммированных клеток, день восемь iEPs образуют два типа колоний, отчетливо красный и не заметно красный. В то время как клетки из красных колоний отображаются эритробластной морфологии, клетки из некрасных колоний этого не сделали. Приблизительно один из 1000 день пять iEPs образуются красные колонии в то время как только примерно один из 10000 колоний, образованных с восьмого дня iEPs.
На эффективность перепрограммирования фибробластов хвостового кончика или ТТФ влияет номер прохода. TTFs, которые были прохождение девять раз показали резкое снижение способности производить кластеры IEPs по сравнению с клетками, которые были пролетев в три раза. Кроме того, различные культурные условия могут повлиять на эффективность перепрограммирования.
Транспродюцированные ТТФ, культурные в нормоксиях, гораздо медленнее перепрограммируются, и кластеры IEP наблюдаются через 10 дней вместо пяти-восьми дней. После этой процедуры для определения статуса дифференциации клеток могут применяться такие методы, как анализ колоний, qPCR и FACS. С момента своего развития, этот метод прокладывает путь для исследователей в области erythropoiesis в понимании переключателя между примитивными и окончательными эритроидных клеток в мыши и человека.
