Riprogrammazione diretta del lignaggio dai fibroblasti alle cellule progenitrici eretroidi. È un nuovo metodo che abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio al fine di studiare meglio i processi di regolazione trascrizionale che determinano il destino delle cellule etiroidi. Il vantaggio principale con l'utilizzo della riprogrammazione diretta del lignaggio per studiare lo sviluppo è che è una tecnica molto semplice.
Quindi rispetto, per esempio, agli studi sulla perdita di funzioni all'interno dei topi knockout, qui possiamo facilmente manipolare il fattore, esprimerlo es esprimono troppo a un certo punto di tempo, e quindi ottenere facilmente abbastanza materiale per studiare effetti a valle come modifiche della cromatina o cambiamenti di espressione genica. Mentre questo metodo si concentra sulla riprogrammazione dei fibroblasti della punta della coda del topo ai progenitori erythroid, può anche essere applicato ad altri tipi di cellule fibroblatrici e ad altri organismi tra cui l'uomo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la medicina trasfusionale in quanto apre la strada alla produzione di globuli rossi in vitro.
A dimostrare la procedura sarà Alban Johansson del mio gruppo di ricerca. Inizia coprendo la superficie dei piatti con gelatina allo 0,1%. Incubarli a 37 gradi Celsius per circa 20 minuti.
Aspirare la soluzione di gelatina e lasciare asciugare i piatti. Usa le forbici per tagliare alla base della coda di un topo eutanasiato per rimuoverlo. Posizionare la coda in DPBS con 2%FBS fino a quando non è pronto per l'uso.
In un cappuccio di coltura tissutale in condizioni sterili, preparare una soluzione diluita di tripina dello 0,02% di tripside EDTA in DPBS e aggiungere 5 millilitri in un piatto non rivestito di 10 centimetri. In una cappa di coltura tissutale, lavare la coda con abbastanza 70% di etanolo in un tubo da 15 millilitri per coprirlo e quindi in DPBS. Posizionare la coda piatta in un piatto e usare le forcelle per tenerla in posizione.
Usa un bisturi per fare un'incisione sulla coda lungo il suo asse longitudinale dalla base alla punta. Utilizzare un paio di pinze per afferrare la coda e tenerla verticalmente e utilizzare un secondo paio per afferrare la pelle accanto all'incisione alla base della coda e sbucciarla. Eseguire questo su entrambi i lati dell'incisione fino a quando la pelle può essere staccata tirando verso il basso verso la punta della coda.
Tenere la coda sbucciata con le forcep sul piatto contenente la soluzione di tripparina. Usa le forbici di dissezione per tagliare la coda a piccoli pezzi. Utilizzare le forbici per frammentare questi pezzi nella soluzione di tripside in pezzi ancora più piccoli e quindi incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Per dissetare la triptina, aggiungere due volumi di mezzo FEX, DMEM con integratori e antibiotici. Raccogliere l'intero contenuto del piatto in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare il tubo a 350 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet contenente i frammenti di coda in 10 millilitri di mezzo FEX fresco. Trasferire questa sospensione su un piatto rivestito di gelatina. Incubare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% e 4% di ossigeno, aggiungendo mezzo FEX fresco ogni due giorni.
Osserva la coltura dopo cinque o sette giorni, in cui i frammenti di coda si sono attaccati sul fondo del piatto e i fibroblasti si stanno allontanando da loro. Una volta che i grappoli di fibroblasti sono visibili, agitare delicatamente il piatto per rimuovere i pezzi di coda. Aspirare il mezzo con tutti i frammenti ossei, lasciando i fibroblasti attaccati alla piastra.
Aggiungere 10 millilitri di mezzo FEX fresco e colturare i fibroblasti fino a confluenti. Per garantire che non vi sia contaminazione da progenitori ematopoietici nella coltura dei fibroblasti, dissociare le cellule dalla piastra utilizzando l'EDTA di tripparina come descritto nel manoscritto. Aggiungere il mezzo e raccogliere le cellule e aggiungere perline magnetiche con anticorpi.
Utilizzare un sistema di separazione magnetica per rimuovere le cellule che esprimono marcatori ematopoietici. Includere questo passaggio è assolutamente vitale perché elimina tutti gli HSPC che potrebbero essere presenti nella cultura e quindi la probabilità di falsi positivi il giorno dell'analisi FACS. Semina cellule di imballaggio retrovirale a circa 25.000 cellule per centimetro quadrato su un piatto trattato con coltura tissutale.
Incubare le cellule in DMEM ad alto glucosio a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante la notte. La mattina seguente, rimuovere il mezzo e aggiungere metà del volume utilizzato per la coltura durante la notte di DMEM senza additivi. Nel pomeriggio, controllare le celle per la confluenza dal 70 all'80% necessaria per la trasfezione.
Inizia la trasfezione preparando una miscela da due a uno di sei microgrammi del vettore di espressione PMX e tre microgrammi del vettore di aiuto contenente geni Gag, Pol e envelope per ogni fattore di riprogrammazione. Successivamente, per ogni fattore di riprogrammazione, aggiungere 300 microlitri di DMEM a temperatura ambiente in un tubo di polistirolo sterile. Quindi aggiungere con cura 27 microlitri di reagente di trasfezione commerciale a temperatura ambiente direttamente nel mezzo per evitare il contatto con la parete del tubo.
Aggiungere la miscela plasmide nel reagente di trasfezione contenente il tubo. Vortice brevemente e incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente. Vortice la miscela di DNA reagente di trasfezione di nuovo.
Aggiungilo dropwise alle celle di imballaggio retrovirale in modo che sia distribuito uniformemente sulla coltura e incubare a 37 gradi Celsius. 24 ore dopo la trasfezione, rimuovere il mezzo e aggiungere DMEM con 20%FBS e 100 unità per millilitro penicillina streptomicina. 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere il supernatante e filtrarlo attraverso un filtro siringa di dimensioni dei pori di 0,22 micrometri.
Inizia la trasduzione seminando i fibroblasti della punta della coda a 10.000 cellule per centimetro quadrato su piatti pre-rivestiti di gelatina allo 0,1% in mezzo FEX. Incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Quando si effettua questo passaggio, è importante aggiungere i quattro supernatanti retrovirali ad un rapporto uguale per garantire che tutti e quattro i transgeni contribuiscano allo stesso modo al processo di riprogrammazione.
Il giorno seguente, preparare una miscela di trasduzione aggiungendo prima un volume di supernatante virale per ogni fattore di riprogrammazione integrato con quattro microgrammi per millilitro di reagente di infezione retrovirale a sei volumi di mezzo FEX. Successivamente, aspirare il mezzo FEX dalla coltura di fibroblasti e aggiungere la miscela di trasduzione. Incubare la reazione di trasduzione per quattro ore a 37 gradi Celsius in condizioni ipossiche al 5% di anidride carbonica e al 4% di ossigeno.
Dopo quattro ore, aspirare la miscela di trasduzione e aggiungere un mezzo di riprogrammazione fresco. Incubare a 37 gradi Celsius in condizioni ipossiche per otto giorni, aggiungendo un mezzo di riprogrammazione fresco ogni due giorni. Osservare una riprogrammazione riuscita con grappoli di celle scollegati dalla piastra.
Per raccogliere le cellule riprogrammate dal piatto per ulteriori analisi, pipettare delicatamente su e giù e quindi raccogliere le cellule. Dopo una riprogrammazione riuscita degli iEP, le cellule positive all'YFP sono osservabili già cinque giorni dopo la trasduzione. Diventano rotondi, si sollevano dalla superficie della piastra, iniziano a formare ammassi e mostrano una morfologia simile a un precursore dell'erioide.
L'emoglobinizzazione di alcune cellule è evidente dalla colorazione positiva della benzidina. Una piccola frazione esprime il marcatore di superficie specifico dell'erythroid TER-119. Entro l'ottavo giorno, si possono vedere grandi cluster positivi all'YFP.
Gli iEP dell'ottavo giorno hanno un fenotipo di eriotroide più differenziato rispetto ai cinque iEP del quinto giorno. Sono significativamente più piccoli, hanno accumulato più emoglobina e mostrano una maggiore espressione di TER-119. L'analisi dell'espressione genica da parte del qPCR degli iEP raccolti all'ottavo giorno mostra che hanno quasi chiuso l'espressione dei geni dei fibroblasti e hanno upregolato molti geni erioidi.
Dopo aver eseguito test di formazione della colonia BFU-e sulle cellule riprogrammate, gli iEP del giorno otto formano due tipi di colonie, distintamente rosse e non visibilmente rosse. Mentre le cellule delle colonie rosse mostravano morfologia degli erythroblast, le cellule provenienti da colonie non rosse non lo facevano. Circa uno su 1.000 giorni cinque iEP formarono colonie rosse mentre solo una su 10.000 colonie si formò dagli iEP del giorno otto.
L'efficienza di riprogrammazione dei fibroblasti o dei TTF della punta della coda è influenzata dal numero di passaggio. I TTF che erano stati passaggi nove volte mostravano una drastica riduzione della capacità di produrre cluster di iEP rispetto alle cellule che erano state passaggio tre volte. Inoltre, diverse condizioni culturali possono influire sull'efficienza della riprogrammazione.
I TTF trasdotti coltivati in normoxia sono molto più lenti da riprogrammare e i cluster IEP vengono osservati dopo 10 giorni invece di cinque o otto giorni. Seguendo questa procedura, metodi come i test di formazione delle colonie, l'analisi qPCR e FACS possono essere applicati al fine di determinare lo stato di differenziazione cellulare. Fin dal suo sviluppo, questa tecnica sta spianando la strada ai ricercatori nel campo dell'eritropoiesi nella comprensione del passaggio tra cellule eritroidi primitive e definitive nel topo e nell'uomo.
