תכנות מחדש של שושלת היוחסין מתאי פיברובלסט לתאי אב אריתרויד. זוהי שיטה חדשה שפיתחנו במעבדה שלנו כדי לחקור טוב יותר את התהליכים של ויסות שעתוק הקובע גורל תא אריתרופיד. היתרון העיקרי בשימוש בתכנות מחדש של שושלת ישרה כדי ללמוד פיתוח הוא שזו טכניקה פשוטה מאוד.
אז בהשוואה, למשל, אובדן של מחקרים פונקציה בתוך עכברים נוקאאוט, כאן אנחנו יכולים בקלות רבה לתפעל את הגורם, לבטא אותו יתר על כן בנקודת זמן מסוימת, ולאחר מכן בקלות לקבל מספיק חומר כדי ללמוד השפעות במורד הזרם כגון שינויים כרומטין או שינויים ביטוי גנים. בעוד שיטה זו מתמקדת בתכנות מחדש של פיברובלסטים קצה הזנב של העכבר לאבות אריתרואידים, ניתן להחיל אותה גם על סוגי תאים פיברובלסטים אחרים, ועל אורגניזמים אחרים כולל בני אדם. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון רפואת עירוי גם כי זה סולל את הדרך לייצור של תאי דם אדומים במבחנה.
הדגמת ההליך תהיה אלבן ג'והנסון מקיום המחקר שלי. התחל על ידי כיסוי פני השטח של הכלים עם 0.1% ג'לטין. דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ 20 דקות.
שאף את תוסף הג'לטין ואפשר למנות להתייבש. השתמש במספריים כדי לחתוך בבסיס הזנב של עכבר המתת סנפיר כדי להסיר אותו. הנח את הזנב ב- DPBS עם 2%FBS עד שהוא מוכן לשימוש.
במכסה המנוע של תרמת הרקמה בתנאים סטריליים, הכינו פתרון טריפסין מדולל של 0.02% טריפסין EDTA ב-DPBS והוסיפו 5 מיליליטר לצלחת לא צותתה של 10 ס"מ. במכסה המנוע של תרבות הרקמות, לשטוף את הזנב מספיק 70%אתנול בצינור 15 מיליליטר כדי לכסות אותו ולאחר מכן ב DPBS. מניחים את הזנב שטוח בצלחת ולהשתמש מדפים להחזיק אותו במקום.
השתמש באזמל כדי לבצע חתך על הזנב לאורך ציר האורך שלו מהבסיס לקצה. השתמש בזוג מעצורים כדי לתפוס את הזנב ולהחזיק אותו אנכית ולהשתמש בזוג שני כדי לאחוז בעור ליד החתך בבסיס הזנב ולקלף אותו בחזרה. בצע זאת משני צידי החתך עד שניתן יהיה לקלף את העור על ידי משיכת כלפי מטה לכיוון קצה הזנב.
החזק את הזנב קלוף עם מדפים מעל המנה המכילה את פתרון טריפסין. השתמש מספריים ניתוח לחתוך את הזנב לחתיכות קטנות. השתמש מספריים כדי לפצל את החלקים האלה בתווית טריפסין לחתיכות קטנות עוד יותר ולאחר מכן דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
כדי להתרווה טריפסין, להוסיף שני כרכים של מדיום FEX, DMEM עם תוספי מזון ואנטיביוטיקה. לאסוף את כל התוכן של המנה לתוך צינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 350 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שאף את העל-טבעי והוסף מחדש את גלולת המכילה את שברי הזנב ב-10 מיליליטר של מדיום FEX טרי. מעבירים את ההשעיה לתבשיל מצופה ג'לטין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני ו 4% חמצן, הוספת מדיום FEX טרי כל יומיים.
שימו לב לתרבות לאחר חמישה עד שבעה ימים, שבהם שברי הזנב מחוברים בתחתית המנה, ופיברובלסטים מתרחקים מהם. לאחר אשכולות של fibroblasts גלויים, בעדינות לנער את המנה כדי לנתק חתיכות הזנב. שאפו את המדיום עם כל שברי העצם, והשאירו את הפיברובלסטים מחוברים לצלחת.
הוסף 10 מיליליטר של מדיום FEX טרי ותרבות fibroblasts עד confluent. כדי להבטיח כי אין זיהום על ידי אבי hematopoietic בתרבות fibroblast, לנתק את התאים מהצלחת באמצעות טריפסין EDTA כמתואר בכתב היד. מוסיפים מדיום ואוסף את התאים ומוסיפים חרוזים מגנטיים עם נוגדנים.
השתמש במערכת הפרדה מגנטית כדי להסיר תאים המבטאים סמנים hematopoietic. הכללת שלב זה היא חיונית לחלוטין משום שהיא מבטלת את כל HSPCs שעשויים להיות נוכחים בתרבות ולכן הסבירות של כל חיובי כוזב ביום הניתוח FACS. תאי אריזה רטרו-ויראליים של זרעים בערך 25,000 תאים לס"מ מרובע על צלחת שטופלה בתרבות הרקמה.
הדגירה את התאים DMEM גלוקוז גבוה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני לילה. בבוקר שלמחרת, הסר את המדיה והוסף מחצית מאמצעי האחסון המשמש לתרבות בן לילה של DMEM ללא תוספים. אחר הצהריים, לבדוק את התאים עבור 70 עד 80% confluency הנדרש עבור transfection.
התחילו את ההטעה על-ידי הכנת תערובת של 2 ל-1 של שישה מיקרוגרם של ה-PMX של וקטור הביטוי ושלושה מיקרוגרם של וקטור המסייע המכיל גנים של Gag, Pol ומעטפה עבור כל גורם תכנות מחדש. לאחר מכן, עבור כל גורם תכנות מחדש, הוסף 300 מיקרוליטרים של DMEM בטמפרטורת החדר בצינור פוליסטירן סטרילי. לאחר מכן הוסיפו בזהירות 27 מיקרוליטרים של רהט מסחרי בטמפרטורת החדר ישירות לתוך המדיום כדי למנוע מגע עם קיר הצינור.
מוסיפים את תערובת הפלסמיד לתוך רגנט transfection המכיל צינור. מערבולת לזמן קצר להחגירה את התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מערבולת תערובת הדנ"א של רגנט הטרנזיקציה שוב.
מוסיפים אותו dropwise לתאי האריזה רטרו-ויראלי, כך שהוא מתפשט באופן שווה על פני התרבות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס. 24 שעות לאחר ההמרה, הסר את המדיום והוסף DMEM עם 20%FBS ו- 100 יחידות למיליליטר פניצילין סטרפטומיצין. 48 שעות לאחר ההמרה, לאסוף את supernatant ולסנן אותו דרך מסנן מזרק בגודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.
התחל את ההעתקה על ידי זריעת fibroblasts קצה הזנב ב 10, 000 תאים לסנטימטר מרובע על 0.1% ג'לטין מצופה מראש כלים במדיום FEX. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. בעת ביצוע שלב זה, חשוב להוסיף את ארבעת העל-טבעיים הרטרו-ויראליים ביחס שווה כדי להבטיח שכל ארבעת הטרנסג'נים יתרמו באופן שווה לתהליך התכנות מחדש.
ביום שלמחרת, להכין תערובת transduction על ידי הוספת תחילה נפח אחד של על טבעי ויראלי עבור כל גורם תכנות מחדש בתוספת ארבעה מיקרוגרם למיליליטר של reagent זיהום רטרו-ויראלי לשישה כרכים של מדיום FEX. לאחר מכן, שאפו את מדיום ה-FEX מתרבות הפיברובלסט והוסיפו את תערובת ההעתקה. דגירה תגובת ההמרה במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים היפוקסיים ב 5%פחמן דו חמצני ו 4% חמצן.
לאחר ארבע שעות, שאפו את תערובת ההתמרה והוסיפו מדיום תכנות טרי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים היפוקסיים במשך שמונה ימים, הוספת בינוני תכנות טרי כל יומיים. שימו לב לתכנות מחדש מוצלח עם אשכולות תאים שהניבו מנותקים מהלרשת.
כדי לקצור תאים מתוכנתים מחדש מהצלחת לניתוח נוסף, בעדינות pipette אותם למעלה ולמטה ולאחר מכן לאסוף את התאים. לאחר תכנות מוצלח של iEPs, תאים חיוביים YFP ניתנים לצפייה כבר חמישה ימים לאחר ההתמרה. הם הופכים עגולים, להרים מפני השטח של הלוח, להתחיל להרכיב אשכולות, ולהציג מורפולוגיה דמוית מבשר אריתרואיד.
המוגלוביניזציה של תאים מסוימים ניכרת על ידי כתמי בנצידין חיוביים. שבר קטן מבטא את סמן פני השטח הספציפי לאניתרויד TER-119. ביום השמיני, ניתן לראות אשכולות גדולים וחיוביים ל-YFP.
יום שמונה iEPs יש פנוטיפ אריתרויד מובחן יותר מאשר יום חמש iEPs. הם קטנים משמעותית, צברו יותר המוגלובין, ומרגנים ביטוי מוגבר של TER-119. ניתוח ביטוי גנים על ידי qPCR של iEPs שנאספו ביום שמונה מראה כי הם כמעט לסגור את הביטוי של גנים fibroblast יש upregulated גנים אריתרואידים רבים.
לאחר ביצוע בדיקות BFU-e להרכבת מושבה על התאים המתוכנתים מחדש, יום שמונה iEPs יוצרים שני סוגים של מושבות, אדום מובהק ולא אדום בעליל. בעוד תאים מהמושבות האדומות הציגו מורפולוגיה אריתרובלסט, תאים מהמושבות הלא אדומות לא. בערך אחד מכל 1,000 יום חמישה iEPs יצרו מושבות אדומות בעוד רק אחד מכל 10, 000 מושבות נוצרו מהיום שמונה iEPs.
יעילות תכנות מחדש של fibroblasts קצה הזנב או TTFs מושפע מספר המעבר. TTFs שעברו תשע פעמים הראו ירידה דרמטית ביכולת לייצר אשכולות של iEPs בהשוואה לתאים שעברו שלושה פעמים. יתר על כן, תנאי תרבות שונים יכולים להשפיע על היעילות של תכנות מחדש.
TTFs מתומרים בתרבות נורמוקסיה הם הרבה יותר איטי לתכנת מחדש אשכולות IEP נצפו לאחר 10 ימים במקום חמישה עד שמונה ימים. לאחר הליך זה, ניתן להחיל שיטות כגון בדיקה יוצרת מושבה, ניתוח qPCR ו- FACS כדי לקבוע את מצב ההידול בין התאים. מאז התפתחותה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום אריתרופויז בהבנת המעבר בין תאים אריתרואידיים פרימיטיביים ומוחלטים בעכבר ובאדם.
