تم الإبلاغ عن إعادة برمجة مباشرة لتوليد الخلايا الصباغية. ومع ذلك ، يتم استخدام عوامل النسخ المختلفة في دراسات مختلفة. في هذا البروتوكول ، قمنا بالتحقق من صحة وتقليل عدد عوامل النسخ مع كفاءة إعادة برمجة أعلى.
أنشأنا نظام إعادة برمجة مباشر لتوليد الخلايا الصباغية باستخدام ثلاثة عوامل نسخ فقط ، Mitf و Sox10 و PAX3 ، وعدلنا نظام الثقافة لجعله أكثر استقرارا وقوة. كيفية تجديد الخلايا الصباغية الوظيفية هو سؤال مهم قد يساعد في معالجة قيود العلاج لأمراض التصبغ مثل البهاق. توفر إعادة البرمجة الصحيحة مستقبلا تتميز تقنيتنا بخصائص الراحة وقابلية التشغيل القوية والاستقرار ، والتي يسهل الترويج لها وتكرارها.
لبدء إنتاج الفيروس الليفي المركز ، قم بصفيحة 1.5 مرة 10 إلى 6 خلايا HEK-293T في طبق 60 ملم ، وزرع الخلايا ذات الوسط الطبيعي عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة من الحضانة ، عندما تصل خلايا HEK-293T إلى 80 إلى 90٪ من الالتقاء ، استبدل الوسط ب 3.5 مل من DMEM ، ثم احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين. بعد إزالة الخلايا من الحاضنة ، استبدل الوسط ب DMEM يحتوي على 2٪ FBS ، وأضف خليط مجمع النقل الطازج إلى الخلايا بطريقة قطرة.
اخلطي الخليط السائل بلطف. عند الانتهاء من ثماني ساعات ، قم بتغيير وسط الخلية ب 3.5 مل من الوسط الطبيعي. جمع supernatant الفيروس في 24 و 48 ساعة.
بعد ذلك ، امزج المواد الفائقة للفيروس التي تم جمعها في نقطتين زمنيتين مختلفتين وقم بالطرد المركزي للخليط عند 200 xg لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم مرر السوبرناتانت الذي تم جمعه من خلال مرشحات 0.45 ميكرون لجمع الترشيح في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. ركز الفيروس الفائق المصفى عن طريق الطرد المركزي عند 6،000 xg عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، تأكد من أن حبيبات الفيروس مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي. صب من supernatant ببطء. لإذابة بيليه الفيروس في الوسط الطبيعي مع واحد في 100 * حجم من supernatant الفيروس.
استخدم ماصة P1000 الدقيقة للماصة لأعلى ولأسفل بلطف حتى يتم الحصول على خليط فيروسات مركز متجانس 100x. قسم الفيروس المركز إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لتخزينها عند 80 درجة مئوية. لوحة 1 في 10 إلى خلايا HEK-293T 5th في بئر واحد من لوحة من ستة آبار.
استزرع هذه الخلايا مع الوسط الطبيعي عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة ، أضف 0.1 إلى 0.2 ميكرولتر من فيروس الفلورسنت المركز 100x إلى كل بئر. يليه إضافة أربعة نانوغرام لكل ميكرولتر من كاشف النقل البوليمري الكاتيوني إلى كل بئر.
بعد حوالي ثماني إلى اثنتي عشرة ساعة من الإصابة بالفيروس ، استبدل الوسط بالوسط العادي. في ثماني وأربعين ساعة بعد الإصابة ، اغسل الطبق ب 1 مل من PBS المعقم لإزالة الخلايا الميتة. ثم التربسين الخلايا باستخدام 250 ميكرولتر من محلول 0.05٪ من التربسين-EDTA لكل بئر من صفيحة من ستة آبار في درجة حرارة الغرفة.
الطرد المركزي للصفيحة عند 200 xg لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة السوبرناتانت ، أعد تعليق حبيبة الخلية في مل واحد من PBS وأضف تعليق الخلية إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة خمسة مل. ثم ضع الأنبوب في مقياس التدفق الخلوي لتحليل العينة.
لإعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية ، قم بتغطية بئر واحد من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من ستة آبار بمحلول 1 مل من محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪ في درجة حرارة الغرفة. بعد 15 إلى 30 دقيقة ، عندما يتم تغطية البئر بالكامل بالجيلاتين ، قم بشفط محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪. بعد ذلك ، قم بلوحة 5 مرات 10 إلى الخلايا الليفية الجنينية الرابعة للفأر ، أو MEFs ، في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار مغلفة ب 0.1٪ من الجيلاتين ، وزرع الخلايا بين عشية وضحاها مع الوسط الطبيعي عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
بعد 24 ساعة ، عندما تصل MEFs إلى 40 إلى 50٪ من الالتقاء ، استبدل الوسط بالوسط العادي. بعد ذلك ، قم بإذابة الفيروس المتجمد المركز على الجليد. احسب حجم الفيروس المراد إضافته باستخدام المعادلة ثم أضف الفيروس المركز لعوامل النسخ الستة إلى كل بئر ، وفقا للحجم المحسوب.
أضف أربعة ميكروغرام لكل مل من عامل النقل البوليمري الكاتيوني إلى البئر. اعتبره اليوم صفر من عدوى الفيروس العاهري. في اليوم الأول ، بعد 8 إلى 12 ساعة من الإصابة ، استبدل الوسط الذي يحتوي على الفيروس بالوسط الطبيعي الطازج ، مع إضافة 0.5 ميكروغرام لكل مل بورومايسين لفحص خطوط الخلايا المصابة المستقرة.
في اليوم الثاني ، بعد 48 ساعة من الإصابة ، استبدل الوسط الفائق تدريجيا بوسيط إعادة البرمجة. تغيير ربع الحجم المتوسط الكلي قبل إضافة ثلاثة ميكرومولار CHIR99021. من اليوم الثالث إلى اليوم السابع ، اعتمادا على حالة الخلايا ، قم بتغيير الوسط عن طريق استبداله تدريجيا بنسبة أعلى من وسيط إعادة البرمجة للتبديل إلى وسيط إعادة البرمجة الكامل في غضون خمسة أيام.
بعد ذلك ، افصل الخلايا ب 500 ميكرولتر من الإنزيم الهضمي التريبسين-EDTA بنسبة 0.05٪ لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. عندما تطفو ما يقرب من ستين في المئة من الخلايا ، توقف عن الهضم عن طريق إضافة الوسط الطبيعي ، مرتين من حجم الإنزيم الهضمي. اجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل لجهاز الطرد المركزي عند 200 xg لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
قم بإزالة supernatant قبل إعادة تعليق بيليه الخلية باستخدام وسيط إعادة البرمجة. عند الانتهاء، قم بطبق الخلايا المعاد تعليقها في طبق معقم بقطر 60 ملم. استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطوبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
بعد ثمان وأربعين ساعة من الإصابة بفيروس lentivirus في خلايا HEK-293T ، تم تقييم نجاح إنتاج فيروس lentivirus المركز من خلال مراقبة كثافة التألق في GFP أو عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم العثور على عيار الفيروس المركز ليكون مرتفعا عند 10 إلى 8th TU / mL. أثناء إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية ، تغير مورفولوجيا الخلية تدريجيا إلى مشبك خلوي ممدود ونوى خلية موسعة.
ومع ذلك ، فإن الخلايا التي تتقدم في العمر تدريجيا بعد اليوم العشرين. أدت إزالة عوامل النسخ ، Mitf أو Pax3 أو Sox10 ، إلى إسكات التعبير عن جينات الخلايا الصباغية ، Tyr ، Tyrp1 ، و Mlana ، مما يشير إلى أكبر تأثير على تحويل الخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية. وبالتالي ، كان التعبير عن جينات الخلايا الصباغية الناجمة عن البرمجة المباشرة مع ثلاثة عوامل نسخ أعلى بالمقارنة مع ستة عوامل نسخ.
لتحديد الخلايا الصباغية التي يسببها MEF ، أو iMels ، تم الكشف عن علامات الخلايا الصباغية ، TYRP1 و DCT باستخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي. علاوة على ذلك ، أظهرت طرق التلطيخ الخاصة بالميلانين مثل DOPA و Masson-Fontana نتائج إيجابية. يجب توزيع الخلايا 293T بالتساوي.
أيضا ، يجب أن تتم إضافة خليط النقل إلى الخلايا بلطف لمنع الخلايا من الطفو. البروتوكول مستقر وعملي ويمكن استخدامه لإعادة برمجة أنواع أخرى من الخلايا. وتتوقع أن توفر مرجعا واستراتيجية لإعادة البرمجة المباشرة في الجسم الحي في تجديد الخلايا الصباغية في الطب المستقبلي.
