섬유아세포에서 에리스로이드 전구 세포로 직접 리프로그래밍합니다. 그것은 우리가 더 나은 에리스 로이드 세포 운명을 결정 하는 전사 규칙의 프로세스를 공부 하기 위해 우리의 실험실에서 개발 하는 새로운 방법. 직접 계보 리프로그래밍을 사용하여 개발을 연구하는 것이 가장 큰 장점은 매우 간단한 기술이라는 것입니다.
따라서 예를 들어, 녹아웃 마우스 내의 기능 연구의 손실에 비해, 여기서 우리는 매우 쉽게 요인을 조작하고, 특정 시점에서 과발현한 다음, 크로마틴 수정 이나 유전자 발현 변화와 같은 다운스트림 효과를 연구하기에 충분한 물질을 쉽게 얻을 수 있습니다. 이 방법은 적혈구 선조에 마우스 꼬리 팁 섬유 아세포의 재프로그래밍에 초점을 맞추고 있지만, 그것은 또한 다른 섬유 아세포 세포 유형, 그리고 인간을 포함한 다른 유기체에 적용 될 수있다. 이 기술의 의미는 체외에서 적혈구의 생산을 향해 길을 포장한다는 점에서 수혈 의학으로 확장됩니다.
절차를 시연하는 것은 내 연구 그룹에서 알반 요한슨이 될 것입니다. 요리의 표면을 0.1%젤라틴으로 덮는 것으로 시작합니다. 약 20 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.
젤라틴 용액을 흡기하고 요리가 건조할 수 있도록 합니다. 가위를 사용하여 안락사 된 마우스의 꼬리 기저에서 잘라 제거합니다. 사용 준비가 될 때까지 2 % FBS와 DPBS에 꼬리를 배치합니다.
멸균 조건하에서 조직 배양 후드에서 DPBS에서 0.02%의 트립신 EDTA의 희석 된 트립신 용액을 준비하고 코팅되지 않은 10 센티미터 접시에 5 밀리리터를 추가하십시오. 조직 배양 후드에서, 충분히 70 %에탄올에 꼬리를 씻어 15 밀리리터 튜브에 그것을 커버한 다음 DPBS에서. 꼬리를 접시에 평평하게 놓고 집게를 사용하여 제자리에 고정하십시오.
메스를 사용하여 기지에서 끝까지 세로축을 따라 꼬리를 절개합니다. 꼬리를 잡고 수직으로 잡고 두 번째 쌍을 사용하여 꼬리 의 바닥에 절개 옆에 피부를 잡고 다시 껍질을 벗깁니다. 피부가 꼬리 끝을 향해 아래쪽으로 당겨 벗겨질 때까지 절개 의 양쪽에서 이것을 수행하십시오.
트립신 용액이 들어 있는 접시 위에 집게로 껍질을 벗긴 꼬리를 잡습니다. 해부 가위를 사용하여 꼬리를 작은 조각으로 자른다. 가위를 사용하여 트립신 용액의 이 조각을 더 작은 조각으로 조각한 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다.
트립신을 담금질하려면, FEX 매체의 두 볼륨을 추가, 보충제와 항생제와 DMEM. 접시의 전체 내용을 50 밀리리터 튜브로 수집합니다. 4°C에서 5분간 350회 G로 튜브를 원심분리합니다.
상류체를 흡인하고 신선한 FEX 배지의 10 밀리리터에 꼬리 조각을 포함하는 펠릿을 재중단합니다. 이 서스펜션을 젤라틴 코팅 요리로 옮기습니다. 이산화탄소 5% 및 산소 4%로 섭씨 37도에서 배양하여 2일마다 신선한 FEX 배지를 추가합니다.
꼬리 조각이 접시의 바닥에 부착하고, 섬유 아세포가 그들로부터 멀리 이동하는 5 ~ 7 일 후 문화를 관찰한다. 섬유아세포 무리가 보이면 접시를 부드럽게 흔들어 꼬리 조각을 빼냅니다. 모든 뼈 조각으로 매체를 흡인하여 섬유아세포가 접시에 부착됩니다.
신선한 FEX 배지의 10 밀리리터를 추가하고 컨서블 될 때까지 섬유 아세포를 배양합니다. 섬유아세포 배양에서 조혈 선조에 의한 오염이 없도록 원고에 설명된 대로 트립신 EDTA를 사용하여 플레이트에서 세포를 분리한다. 배지를 추가하고 세포를 수집하고 항체를 가진 자기 구슬을 추가합니다.
자기 분리 시스템을 사용하여 조혈 마커를 표현하는 세포를 제거합니다. 이 단계를 포함 하면 절대적으로 중요 한 문화권에 존재 할 수 있는 어떤 HSPC를 제거 하 고 따라서 FACS 분석의 날에 어떤 거짓 긍정의 가능성. 종자 레트로바이러스 포장 세포는 조직 배양에 평방 센티미터 당 약 25, 000 세포치료 접시에.
하룻밤 사이에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 고혈당 DMEM으로 세포를 배양합니다. 다음 날 아침, 매체를 제거하고 첨가제없이 DMEM의 하룻밤 문화에 사용되는 절반 볼륨을 추가합니다. 오후에는 세포가 트랜스페션에 필요한 70~80%의 수렴성을 확인합니다.
각 리프로그래밍 인자에 대해 개그, 폴 및 봉투 유전자를 포함하는 발현 벡터 PMX의 6마이크로그램과 도우미 벡터의 3마이크로그램의 2~1마이크로그램의 혼합물을 준비하여 트랜스페션을 시작합니다. 다음으로, 각 리프로그래밍 계수에 대해 멸균 폴리스티렌 튜브에 실온 DMEM 300 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브 벽과의 접촉을 피하기 위해 27 마이크로리터의 실온 상용 형질 시약을 배지에 직접 추가하십시오.
플라스미드 믹스를 튜브를 포함하는 트랜스펙트 시약에 넣습니다. 소용돌이를 잠깐 배양하고 실온에서 15 분 동안 혼합물을 배양합니다. 다시 배혈 시약 DNA 혼합물을 소용돌이.
그것은 균양에 균등하게 확산되도록 레트로 바이러스 포장 세포에 드롭 와이즈를 추가하고 섭씨 37도에서 배양. 트랜스펙트 후 24시간, 배지를 제거하고 밀리리터 페니실린 연쇄상구균제당 20%의 FBS와 100단위로 DMEM을 추가합니다. 48 시간 후, 상체를 수집하고 0.22 마이크로 미터 모공 크기 주사기 필터를 통해 필터링.
FEX 배지에서 0.1%의 젤라틴 프리 코팅 접시에 10, 평방 센티미터당 000 세포에서 꼬리 팁 섬유아세포를 시드하여 변환을 시작합니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하세요. 이 단계를 수행할 때 4개의 레트로바이러스 수퍼네이넌트는 모두 4개의 트랜스게네스가 리프로그래밍 프로세스에 동등하게 기여하도록 하는 것이 중요합니다.
다음 날, 레트로바이러스 감염 시약의 밀리리터 당 4마이크로그램으로 보충된 각 리프로그래밍 인자에 대해 먼저 1부의 바이러스 성 상체를 6권에 추가하여 전균 혼합물을 준비한다. 그 후, 섬유아세포 배양으로부터 FEX 배지를 흡인시키고 배관 혼합물을 첨가한다. 이산화탄소 5%와 산소 4%로 저산소 조건에서 섭씨 37도에서 4시간 동안 트랜스듀션 반응을 배양합니다.
4시간 후, 트랜스포션 혼합물을 흡인하고 신선한 재프로그래밍 매체를 추가합니다. 저산소 조건에서 섭씨 37도에서 8일 간 배양하여 2일마다 신선한 재프로그래밍 배지를 추가합니다. 플레이트에서 분리된 셀 클러스터로 성공적인 재프로그래밍을 관찰합니다.
추가 분석을 위해 접시에서 다시 프로그래밍 된 세포를 수확하려면 부드럽게 위아래로 피펫한 다음 세포를 수집합니다. iEP의 성공적인 재프로그래밍 후, YFP 양성 세포는 변환 후 5 일 일찍 관찰 할 수 있습니다. 그(것)들은 둥글게 되고, 판의 표면에서 들어 올려, 클러스터를 형성하기 시작하고, 에리스로이드 전구체 같이 형태를 표시합니다.
일부 세포의 헤모글로빈화는 긍정적 인 벤지딘 염색에 의해 분명하다. 작은 분획은 적혈구 특이적 표면 마커 TER-119를 표현한다. 8일째에는 YFP 양성 클러스터를 크게 볼 수 있습니다.
8일째 iEP는 5일째 iEP보다 더 차별화된 적혈구를 가지고 있다. 그들은 훨씬 작고, 더 많은 헤모글로빈을 축적하고, TER-119의 증가 된 표현을 보여줍니다. 8일째에 수집된 iEP의 qPCR에 의한 유전자 발현 분석은 섬유아세포 유전자의 발현을 거의 종료하고 많은 에리스로이드 유전자를 강화했다는 것을 보여줍니다.
다시 프로그래밍 된 세포에 BFU-e 식민지 형성 에세이를 수행 한 후, 8 일째 iEP는 뚜렷하게 빨간색과 눈에 띄게 빨간색이 아닌 두 가지 유형의 식민지를 형성합니다. 적색 식민지에서 세포는 에리스로 블라스트 형태를 표시하는 동안, 비 붉은 식민지에서 세포는하지 않았다. 1, 000일 5ipPs중 약 1개는 붉은 식민지를 형성하고 10명 중 약 1개, 000개의 식민지가 8일째iEP에서 형성되었습니다.
테일 팁 섬유아세포 또는 TTF의 재프로그래밍 효율은 통로 수의 영향을 받습니다. 9번 통과되었던 TTF는 세 번 통과된 세포에 비해 iEP 클러스터를 생성하는 능력에 극적인 감소를 보였다. 또한 다양한 문화 조건은 재프로그래밍의 효율성에 영향을 줄 수 있습니다.
노목시아에서 배양된 트랜스듀싱된 TTF는 재프로그래밍속도가 훨씬 느리며, IEP 클러스터는 5~8일이 아닌 10일 후에 관찰된다. 이 절차에 따라, 세포 분화 상태를 결정하기 위해 콜로니 형성 분석, qPCR 및 FACS 분석과 같은 방법이 적용될 수 있다. 그것의 발달 부터, 이 기술은 마우스와 인간에 있는 원시적이고 확실한 적혈구 세포 사이 전환을 이해하는 에리스로포에이즘의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장하고 있습니다.
