يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء، مثل كيفية إنشاء أنواع الخلايا المتنوعة وتنظيمها في هياكل ترتيب أعلى مع وظائف محددة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل تنقية الخلايا الموجودة بوفرة منخفضة في نظام دروسوفيليا البصري للتحليل النسخي والمجين. يوم الثلاثاء من الأسبوع السادس من البروتوكول، قبل 45 دقيقة من التشريح، استرداد قارورة واحدة من مسحوق الباباين من أربع درجات مئوية واحتضانه في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك، خصص "متوسط شنايدر الكامل"، أو "سي أس إم"، في أنبوب "إيبندورف" في درجة حرارة الغرفة لإضافته إلى مسحوق "البابين" لاحقاً. خمس إلى عشر دقائق قبل التشريح، واستخدام حقنة لإضافة درجة حرارة الغرفة CSM إلى قارورة من الباباين مباشرة من خلال الغطاء إلى تركيز 100 وحدة لكل ملليلتر. لخلط، أولا عكس القارورة لالتقاط أي مسحوق عالقة في الداخل من الغطاء ومن ثم ماصة محتويات صعودا وهبوطا.
بعد خلط الكواشف، وجلب الماء تصل إلى 37 درجة مئوية في منقار في حمام مائي. ثم ضع القارورة في القارورة لمدة 30 دقيقة لتنشيط البابين وتأكد من أن القارورة ليست عائمة. في حين أن papain هو احتضان، واسترداد aliquot من مزيج انزيم proteolytic من الفريزر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة.
بعد 30 دقيقة من التنشيط، احتضان papain في درجة حرارة الغرفة. يوم الثلاثاء من الأسبوع السادس ، تشريح أدمغة التلميذ نظمت في CSM الباردة مع ملقط نظيفة. تشريح أكبر عدد ممكن من العقول في 10 دقائق وتجمع العقول في قطرة جديدة من CSM الباردة.
قطع الفصوص البصرية عن طريق معسر عند تقاطع الفص البصري والدماغ المركزي. بعد ذلك، إضافة فصوص إلى الجزء السفلي من microtube التي تحتوي على 500 ميكرولترات من 1X RS. ميكروتيوب واحد للأنسجة التجريبية و واحد للأنسجة التحكم السلبية. إبقاء الأنابيب على الجليد.
تشريح أكبر عدد ممكن من الفصوص في ساعة واحدة. تجمع الفصوص البصرية تشريح في microtube واحد للقضاء على فقدان الأنسجة أثناء النقل بين microtubes. قم بإزالة 1x RS بعناية من الأنابيب الدقيقة باستخدام الفصوص البصرية التشريحية باستخدام ماصة P200 ، مما يترك حلًا كافيًا لتغطية الفصوص.
إضافة بعناية 500 ميكرولترات من 1X RS إلى جانب الأنبوب. دع الفصوص تستقر في قاع الأنبوب ، ثم ماصة تصل إلى 200 ميكرولترات. طرد المزيج، ومراقبة فصوص تتحرك والسماح للفص لتسوية مرة أخرى.
لعينتين، aliquot 600 ميكرولترات من تنشيط، درجة حرارة الغرفة papain في microtube. بعد ذلك، قم بإنشاء حل الانفصام. إضافة 4.2 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة مزيج انزيم proteolytic في 600 ميكرولترات من حل باباين للحصول على تركيز نهائي من 0.18 وو لكل ملليلتر وخلط الحل عن طريق الأنابيب عليه صعودا وهبوطا.
ثم إزالة بعناية 1X RS من كل عينة وإضافة 300 ميكرولترات من حل الانفصام إلى الفصوص. احتضان العينات في 25 درجة مئوية. 1000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في ثيرموميكسير microtube.
في 5 و 10 دقيقة من النقاط الزمنية، ووقف ThermoMixer والسماح للفص بالوعة إلى الجزء السفلي من microtube. ماصة تصل 200 ميكرولترات من الحل ومزيج. بعد الحضانة 15 دقيقة، انتظر الفصوص لتستقر إلى أسفل وإزالة بعناية حل الانفصام من الفصوص دون إزعاج الفصوص.
اغسل الفصوص مرتين بـ 1x RS. إضافة بعناية 500 ميكرولترات من 1X RS دون إزعاج الفصوص. ثم بعناية ماصة تصل 200 ميكروليتر وطرد بلطف الحل. السماح للفص إلى بالوعة إلى أسفل وتكرار.
بعد ذلك، قم بغسل كل عينة مرتين بـ 500 ميكرولترات من CSM. إزالة بعناية CSM وإضافة آخر 200 ميكرولترات من CSM إلى الأنبوب. باستخدام ماصة P200، تعطيل الأنسجة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا دون رغوة حتى الحل هو متجانس.
باستخدام ماصة P200، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال غطاء شبكي 30 ميكرومتر في أنبوب فاكس 5 ملليلتر على الجليد. وتأكد من أن التعليق بأكمله يمر. إضافة 500 microliters من CSM لشطف ميكروتيتوب الانفصام.
وتصفية الحل في أنبوب الفاكس. وأخيرا، اخلع بعناية غطاء أنبوب الفاكس. جمع الحل تحت مرشح شبكة مع P200 وإضافته إلى بقية التعليق في أنبوب الفاكس.
المجهر Confocal من الفصوص الملطخة مناعية مع الأجسام المضادة محددة ضد DsRed وGFP وكذلك الأجسام المضادة 24B10 كمرجع لlmina وMidulla neuropils أكد أن L3 هو نوع الخلية الوحيدة التي تحمل علامة DsRed و GFP في الفص البصري. تم تسجيل بيانات حقائق من 100,000 حدث، منها 29.9٪ من جميع الأحداث هي من الـ singlets المحتملة. بعد doublets في الخلايا ذات أحجام مختلفة كانت مسور على أساس التفاصيل والحجم، والخلايا الفردية المتبقية، L3 الخلايا العصبية، كما ظهرت مجموعات ضيقة في P1، الذي كان جيدا فصل عن خلايا الخلفية.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل RNA-seq أو ATAC-seq لمعالجة المسائل البيولوجية من خلال تحليل التعبير الجيني أو منظمة الكروماتين، على التوالي. هذه التقنية تقدم إلى حد كبير قدرة الباحثين على استكشاف الآليات الوراثية الكامنة في تطوير ووظيفة الأنسجة المعقدة باستخدام نظام Drosophila البصرية كنموذج.
