Diese Methode kann dabei helfen, wichtige Fragen in der Biologie zu beantworten, z. B. wie verschiedene Zelltypen generiert und in Strukturen höherer Ordnung mit bestimmten Funktionen organisiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine effiziente Reinigung von Zellen ermöglicht, die in geringer Häufigkeit im visuellen System von Drosophila für die transkriptomische und genomische Analyse vorhanden sind. Am Dienstag der sechsten Woche des Protokolls, 45 Minuten vor den Sezierungen, holen Sie eine Durchstechflasche mit Papainpulver aus vier Grad Celsius und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur.
Als nächstes legen Sie Complete Schneider es Medium, oder CSM, in einer Eppendorfer Röhre bei Raumtemperatur beiseite, um das Papainpulver später zu ergänzen. Fünf bis zehn Minuten vor den Sezierungen verwenden Sie eine Spritze, um die Raumtemperatur CSM der Durchstechflasche mit Papain direkt durch die Kappe zu einer Konzentration von 100 Einheiten pro Milliliter hinzuzufügen. Um zu mischen, zuerst invertieren Sie die Durchstechflasche, um jedes Pulver auf der Innenseite der Kappe stecken zu erfassen und dann Pipette den Inhalt nach oben und unten.
Nach dem Mischen der Reagenzien das Wasser bis zu 37 Grad Celsius in einem Becher in einem Wasserbad bringen. Legen Sie dann die Durchstechflasche 30 Minuten lang in den Becher, um das Papain zu aktivieren und sicherzustellen, dass die Durchstechflasche nicht schwebt. Während das Papain inkubiert, holen Sie sich eine Aliquot proteolytischer Enzymmischung aus dem Gefrierschrank und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur.
Nach 30 Minuten Aktivierung das Papain bei Raumtemperatur inkubieren. Am Dienstag der sechsten Woche, sezieren Sie die inszenierten Pupillen Gehirne in kalten CSM mit sauberen Zangen. Sezieren Sie so viele Gehirne wie möglich in 10 Minuten und bündeln Sie die Gehirne in einem frischen Tropfen kalten CSM.
Schneiden Sie die optischen Lappen ab, indem Sie an der Kreuzung des Optischen Lappens und des zentralen Gehirns kneifen. Als nächstes fügen Sie die Lappen an den Boden eines Mikrorohrs mit 500 Mikroliter nx RS hinzu. Ein Mikrorohr für das Versuchsgewebe und eines für das negative Kontrollgewebe. Halten Sie die Rohre auf Eis.
Sezieren Sie so viele Lappen wie möglich in einer Stunde. Bündeln Sie die sezierten optischen Lappen in einem einzigen Mikrorohr, um Gewebeverluste während des Transfers zwischen Mikroröhren zu eliminieren. Entfernen Sie vorsichtig den 1x RS aus dem Mikrorohr mit den sezierten optischen Lappen mit einer P200 Pipette, so dass genügend Lösung, um die Lappen zu bedecken.
500 Mikroliter 1x RS vorsichtig an die Seite des Rohres geben. Lassen Sie die Lappen auf den Boden des Rohres absetzen, dann Pipette bis 200 Mikroliter. Vertreiben Sie die Mischung, beobachten Sie die Lappen bewegen und lassen Sie die Lappen wieder zu begleichen.
Für die beiden Proben, aliquot 600 Mikroliter aktiviert, Raumtemperatur Papain in einem Mikrorohr. Erstellen Sie als Nächstes die Dissoziationslösung. Fügen Sie 4,2 Mikroliter Raumtemperatur proteolytische Enzym-Mischung in 600 Mikroliter Papain-Lösung, um eine endgültige Konzentration von 0,18 WU pro Milliliter zu erhalten und mischen Sie die Lösung durch Pipettieren.
Entfernen Sie dann vorsichtig den 1x RS aus jeder Probe und fügen Sie 300 Mikroliter Dissoziationslösung in die Lappen. Inkubieren Sie die Proben bei 25 Grad Celsius. 1 000 U/min für 15 Minuten in einem Mikrorohr ThermoMixer.
Stoppen Sie bei den 5 und 10 Minuten den ThermoMixer und lassen Sie die Lappen auf den Boden des Mikrorohrs sinken. Pipette bis 200 Mikroliter der Lösung und mischen. Warten Sie nach der 15-minütigen Inkubation, bis sich die Lappen nach unten absetzen, und entfernen Sie vorsichtig die Dissoziationslösung aus den Lappen, ohne die Lappen zu stören.
Waschen Sie die Lappen zweimal mit 1x RS. 500 Mikroliter 1x RS vorsichtig hinzufügen, ohne die Lappen zu stören. Dann sorgfältig Pipette bis 200 Mikroliter und sanft vertreiben die Lösung. Lassen Sie die Lappen nach unten sinken und wiederholen.
Als nächstes waschen Sie jede Probe zwei Mal mit 500 Mikroliter CSM. Entfernen Sie das CSM vorsichtig und fügen Sie weitere 200 Mikroliter CSM in die Röhre. Mit einer P200 Pipette, stören Sie das Gewebe durch Pipettieren nach oben und unten ohne Schaum, bis die Lösung homogen ist.
Mit einer P200-Pipette filtern Sie die Zellsuspension durch eine 30-Mikrometer-Netzkappe in ein 5 Milliliter Faxrohr auf Eis. Und stellen Sie sicher, dass die gesamte Federung durchgeht. Fügen Sie 500 Mikroliter CSM hinzu, um das Dissoziationsmikrorohr zu spülen.
Und filtern Sie die Lösung in das Faxrohr. Nehmen Sie schließlich die Kappe des Faxrohrs vorsichtig ab. Sammeln Sie die Lösung unter dem Netzfilter mit einem P200 und fügen Sie sie dem Rest der Aufhängung im Faxrohr hinzu.
Die konfokale Mikroskopie von immungefärbten Lappen mit Antikörpern spezifisch gegen DsRed und GFP sowie der 24B10 Antikörper als Referenz für die Neuropils Lamina und Medulla bestätigten, dass L3 der einzige Zelltyp ist, der sowohl von DsRed als auch von GFP im optischen Lappen gekennzeichnet ist. Es wurden Daten von 100.000 Ereignissen erfasst, von denen 29,9 % aller Ereignisse potenzielle Singlets sind. Nachdem Doublets in Zellen mit unterschiedlichen Größen basierend auf Granularität und Größe abgezäut tumnetten, erschienen die verbleibenden Einzelzellen, L3-Neuronen, als enge Cluster in P1, das gut von den Hintergrundzellen getrennt war.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie RNA-seq oder ATAC-seq durchgeführt werden, um biologische Fragen durch die Analyse der Genexpression bzw. Chromatin-Organisation zu beantworten. Diese Technik verbessert die Fähigkeit der Forscher, die genetischen Mechanismen zu erforschen, die der Entwicklung und Funktion komplexer Gewebe zugrunde liegen, indem sie das visuelle System Von Drosophila als Modell verwenden.
