この方法は、多様な細胞タイプが生成され、特定の機能を持つより高い順序の構造に編成されるなど、生物学における重要な質問に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、転写およびゲノム解析のためのショウジョウバエ視覚システムにおいて低い存在する細胞の効率的な精製を促進することです。プロトコルの第6週の火曜日、解剖の45分前に、摂氏4度からパパインパウダーのバイアルを1本取り出し、室温でインキュベートする。
次に、完全なシュナイダーの媒体、またはCSMを室温でエペンドルフチューブに取っておき、後でパパインパウダーに加えます。解剖の5〜10分前に、シリンジを使用して、キャップを通してパパインのバイアルに室温CSMを直接1ミリリットル当たり100単位の濃度に加える。混合するには、まずバイアルを反転してキャップの内側に貼り付いた粉末を取り込み、その後、内容物を上下にピペットします。
試薬を混合した後、水浴中のビーカーに37°Cまで水を持って来ます。その後、ビーカーにバイアルを30分間置いてパパインを活性化し、バイアルが浮かんでいないことを確認します。パパインがインキュベートしている間に、フリーザーからタンパク質分解酵素ブレンドのアリコートを取り出し、室温でインキュベートする。
30分間の活性化後、パパインを室温でインキュベートする。第6週の火曜日に、きれいな鉗子で冷たいCSMでステージングされた瞳孔の脳を解剖する。10分でできるだけ多くの脳を解剖し、冷たいCSMの新鮮な滴で脳をプールします。
視ローブと中央脳の接合部をつまんで視頭葉を切断します。次に、1x RSの500マイクロリットルを含むマイクロチューブの底にローブを追加します。実験組織用のマイクロチューブ1つと陰性対照組織用のマイクロチューブ1本。チューブを氷の上に置いておきなさい。
1時間でできるだけ多くのローブを解剖する。マイクロチューブ間の移動中の組織損失を排除するために、解剖された光学ローブを単一のマイクロチューブにプールします。P200ピペットを使用して解剖された光学ローブを使用してマイクロチューブから1x RSを慎重に取り出し、ローブを覆うのに十分な溶液を残します。
慎重にチューブの側面に1x RSの500マイクロリットルを追加します。ローブをチューブの底に落ち着かせ、ピペットを200マイクロリットル上げます。ミックスを排出し、ローブが動いているのを観察し、ローブが再び落ち着くようにします。
2つのサンプルについては、アリコート600マイクロリットルの活性化された、室温パパインをマイクロチューブにする。次に、解離ソリューションを作成します。4.2マイクロリットルの室温タンパク質分解酵素を600マイクロリットルのパパイン溶液にブレンドして、1ミリリットル当たり0.18 WUの最終濃度を得て、溶液を上下にピペット処理して混合します。
その後、各サンプルから慎重に1x RSを取り出し、300マイクロリットルの解離溶液をローブに加えます。25°Cでサンプルをインキュベートします。マイクロチューブサーモミキサーで15分間1,000 RPM。
5分と10分のタイムポイントで、ThermoMixerを停止し、ローブをマイクロチューブの底に沈めます。ピペットアップ 200 溶液と混合のマイクロリットル.15分間のインキュベーションの後、ローブが底に落ち着くのを待ち、ローブを邪魔することなく慎重に脱離溶液をローブから取り除きます。
1x RSでローブを2回洗います。1x RSの500マイクロリットルを慎重に加え、ローブを邪魔します。その後、慎重に200マイクロリットルをピペットアップし、穏やかに溶液を排出します。ローブを底に沈め、繰り返します。
次に、各サンプルを500マイクロリットルのCSMで2回洗浄します。慎重にCSMを取り外し、さらに200マイクロリットルのCSMをチューブに加えます。P200ピペットを使用して、溶液が均質になるまで泡立たずに上下にピペット化して組織を破壊する。
P200ピペットを使用して、30マイクロメートルのメッシュキャップを通して、氷の上の5ミリリットルのファックスチューブに細胞懸濁液をフィルター処理します。そして、サスペンション全体が通過することを確認してください。500マイクロリットルのCSMを加えて、解離マイクロチューブをすすいでください。
そして、ファクスチューブに溶液をフィルタリングします。最後に、ファックス管のキャップを慎重に取り外します。P200でメッシュフィルターの下にソリューションを収集し、ファックスチューブのサスペンションの残りの部分に追加します。
DsRedおよびGFPに特異的な抗体を有する免疫染色されたローブの共焦点顕微鏡と、ラミナおよび髄質神経ピルスの基準として24B10抗体は、L3が光学ローブのDsRedおよびGFPの両方によって標識された唯一の細胞タイプであることを確認した。100,000件のイベントのファクトデータが記録され、そのうち全イベントの29.9%がシングル候補です。異なるサイズの細胞のダブレットが粒度とサイズに基づいてゲートアウトされた後、残りの単一細胞であるL3ニューロンは、バックグラウンドセルから十分に分離されたP1でタイトなクラスターとして現れました。
この手順に従って、RNA-seqまたはATAC-seqのような他の方法は、それぞれ遺伝子発現またはクロマチン組織の分析を通じて生物学的な質問に対処するために行うことができる。この技術は、ショウジョウバエ視覚システムをモデルとして使用して、複雑な組織の発達と機能の根底にある遺伝的メカニズムを探求する研究者の能力を大幅に進歩させる。
