يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البيولوجيا الجزيئية والمجالات الوراثية لـ Hymenoptera، مثل أنظمة تحديد الجنس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا يمكن أن نحفز بسهولة خطوط التكاثر على النمل فولينهوفيا إيمري ، والتي تعتبر ضرورية لرسم الخرائط الجينية والحالة الجزيئية. لذلك، يمكن لهذه البعثة تقديم نظرة ثاقبة في نظام تحديد الجنس من نملة محددة ويمكن أيضا أن تطبق على النمل الأخرى وأنواع هايمنوبتيرا الأخرى، مثل الدبابير.
لبدء البروتوكول، وجمع مستعمرات V.Emeryi خلال أوائل الصيف. نقل عينات النمل من الفروع التي تم جمعها إلى عش الجص الاصطناعي مع غطاء زجاجي، وذلك باستخدام الزبّب. الحفاظ على المستعمرات في العش الاصطناعي في 25 درجة مئوية، في إطار دورة 16-8 ساعة ضوء الظلام.
توفير مياه الصنبور مع زجاجة غسل للحفاظ على رطوبة الجص كل يومين في نفس الوقت. بعد ذلك ، أضف حوالي 100 ميكروغرام من مسحوق الكريكيت الجاف الملفوف برقائق الألومنيوم ورأس مملوء بالماء البني إلى المستعمرة ، باستخدام طرف 20 ميكرولتر كل يوم حتى يظهر النمل الإنجابي الجديد. من المهم جمع المستعمرات الصغيرة من الحقول وتوفير ما يكفي من الغذاء للحصول على ملكات و ذكور جدد.
أولاً، منع الأفراد من التحرك عن طريق وضع المستعمرات في غرفة ذات بيئة خاضعة للرقابة تبلغ أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. إزالة منتصف الساقين من 30 النمل العامل باستخدام ملقط تحت منظار مجسم لتمييز الجيل F-صفر من العمال المنتجة في الصلبان التكاثرية اللاحقة. ثم نقل النمل إلى عش الجص أصغر جديدة لالانتجين الصلبان.
بعد ذلك ، أضف ثلاث إلى أربع يرقات أو عانة في عش الجص الذي يحتوي على العمال. نقل ملكة طويلة مجنحة و ذكر إلى عش الجص المعدة مسبقا لالصلان التزاوج. لهذه الخطوة، من المهم الحفاظ على مستعمرة عبور تجريبية في نفس الحالة مثل تلك التي من مستعمرة عادية.
من الصعب الحث على التكاثر عن طريق وضع الذكور والإناث معا. الحفاظ على المستعمرات في 25 درجة مئوية تحت ضوء 16 إلى 8 ساعات، ودورة مظلمة مع الغذاء والماء المقدمة حتى تفقد الملكة جناحيها ويضع البيض. تحقق من المستعمرة التجريبية كل يوم تحت مجهر ستيريو.
بعد إعداد الصلبان التزاوجية بين ذرية F-One ، يمكن ملاحظة البيض تحت المنظار المجسم. بعد أن تبدأ ملكة F-One في وضع البيض ، وإزالة الذكور F-one واليرقات أو العانة من العش لمنع جيل F-One وجيل F-2 من الاختلاط. إبقاء المستعمرات تحت نفس الظروف حتى ذرية F-اثنين تظهر.
إزالة ساق واحدة من F-صفر الملكة باستخدام ملقط. نقل الساق إلى أنبوب 1.5 ملليلتر الصغيرة التي تحتوي على 100 ميكرولترات من عامل البرد. تحت منظار مجسم تشريح بطن أنثى في طبق زجاجي مليء 300 ميكرولترات من الماء النقي جدا باستخدام ملقط.
يختلف عن الحيوانات المنوية التي تحتوي على الحيوانات المنوية من الذكور تزاوج. قشر بعيدا أنسجة الحيوانات المنوية وعزل الحيوانات المنوية من أنسجة الإناث باستخدام دبابيس الحشرات. باستخدام وسادة فطيرة صغيرة، نقل الحيوانات المنوية إلى أنبوب صغير 1.5 ملليلتر تحتوي على 100 ميكرولترات من عامل البرد.
احتضان العينات من الملكة F-صفر والحيوانات المنوية في 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. فلاش سنترو الصمامات أنبوب صغير وتخزين العينات في أربع درجات مئوية. بعد تأكيد إنتاج البيض من قبل ملكة F-One التي تتزاوج مع siv، قم باستخراج الحمض النووي للملكة باستخدام أجنحة السقيفة أو ساق واحدة أو متوسطة وجينية.
بعد ذلك، استخراج الحمض النووي لذكر F-واحد عن طريق genotyping ساق واحدة. لتقييم خصوبة النمل الذكور من الصلبان التكاثرية ، تشريح الأعضاء التناسلية الداخلية في طبق زجاجي مع 400 ميكرولترات من محلول PBS باستخدام ملقط. ثم إزالة برنامج تلفزيوني واستبداله مع أربعة في المئة paraformaldihyde باستخدام وسادة فطيرة صغيرة.
إصلاح الأنسجة عن طريق احتضان العينات في PFA لمدة أربعين دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت، وغسل الأنسجة خمس مرات مع 400 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني باستخدام وسادة فطيرة صغيرة. تخفيف DAPI حل لمليغرام واحد لكل ملليلتر في برنامج تلفزيوني.
إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة ما يقرب من 300 ميكرولترات من المخفف DAPI تلطيخ حل للأنسجة. احتضان الأنسجة لمدة 15 دقيقة في ظل ظروف مظلمة درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، وغسل الأنسجة خمس مرات مع 400 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني ونقل الأنسجة إلى وسط شريحة زجاجية باستخدام ملقط.
ثم قم بتركيب الأنسجة على تركيب وسط يحتوي على ثلاثية ثلاثية الثوار رباعية الأراضي. وأخيراً مراقبة العينات مع مجهر المسح الليزر confocal باستخدام العدسات 20 أو 60 3x الهدف. صور مجهرية من الخصيات من الذكور Haploid الخامس Emeryi تظهر الأنسجة الليفية الصحية أو الحيوانات المنوية التي هي غائبة في ديبلويد الذكور ضد Emeryi، والتي لم تظهر الأنسجة الليفية صحية.
الأعضاء التناسلية الذكور من الذكور Diploid ضد Emeryi لم تنتج الحيوانات المنوية والخصية لم تتطور، مما يشير إلى أن الذكور المنتجة في الصلبان التزاوج هي عقيمة. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق لنا لاستكشاف myatony الجنس في ثابت في Vollenhovia Emeryi لأنواع النمل التوقيت السريع.
