Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la biologie moléculaire et les sphères génétiques des hyménoptères, telles que les systèmes de détermination du sexe. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons facilement induire des lignes de consanguinité sur la fourmi Vollenhovia Emery, qui sont essentielles pour la cartographie génétique et le statut moléculaire. Ainsi, cette mission peut fournir un aperçu du système de détermination du sexe d’une fourmi spécifique et il peut également être appliqué à d’autres fourmis et d’autres espèces d’hyménoptères, comme les guêpes.
Pour commencer le protocole, recueillir les colonies V.Emeryi au début de l’été. Transférer les spécimens de fourmis des branches recueillies dans un nid de plâtre artificiel avec un couvercle en verre, à l’aide d’un aspirateur. Maintenir les colonies dans le nid artificiel à 25 degrés C, sous un cycle clair-obscurité de 16 à huit heures.
Fournir de l’eau du robinet avec une bouteille de lavage pour garder le plâtre humide tous les deux jours en même temps. Ensuite, ajoutez environ 100 microgrammes de poudre de cricket sec enveloppé dans du papier d’aluminium et une pointe remplie d’eau de cassonade à la colonie, à l’aide d’une pointe de 20 microlitres tous les deux jours jusqu’à ce que de nouvelles fourmis reproductrices émergent. Il est important de recueillir des micro-colonies dans les champs et de leur fournir suffisamment de nourriture pour acquérir de nouvelles reines et mâles.
Tout d’abord, empêcher les individus de se déplacer en plaçant des colonies dans une pièce avec un environnement contrôlé fixé à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Retirez les jambes moyennes de 30 fourmis ouvrières à l’aide de forceps sous un stéréoscope pour distinguer la génération F-zéro des travailleurs produits dans les croisements de consanguinité subséquents. Transférer ensuite les fourmis dans un nouveau nid de plâtre plus petit pour la consanguinité des croix.
Ensuite, ajoutez trois à quatre larves ou pubis dans un nid de plâtre contenant des travailleurs. Transférer une longue reine ailé et un mâle dans un nid de plâtre préalablement préparé pour la consanguinité des croix. Pour cette étape, il est important de maintenir la colonie expérimentale de croisement au même état que celle d’une colonie normale.
Il est difficile d’induire la consanguinité simplement en plaçant les mâles et les femelles ensemble. Gardez les colonies à 25 degrés Celsius sous un cycle sombre de 16 à 8 heures avec de la nourriture et de l’eau fournies jusqu’à ce que la reine perde ses ailes et ponde des œufs. Vérifiez la colonie expérimentale tous les jours au microscope stéréo.
Après avoir mis en place les croisements de consanguinité entre la progéniture F-one, les œufs peuvent être observés sous stéréoscope. Après que la reine F-one commence à pondre des œufs, retirez les mâles et les larves f-one ou le pubis du nid pour empêcher la génération F-1 et la génération F-deux de se mélanger. Gardez les colonies dans les mêmes conditions jusqu’à ce que la progéniture F-deux émerge.
Retirez une jambe d’une reine F-zéro à l’aide de forceps. Transférer la jambe dans un micro tube de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres d’un agent de refroidissement. Sous un stéréoscope disséquer un abdomen féminin dans un plat en verre rempli de 300 microlitres d’eau ultra pure à l’aide de forceps.
Dissimilate le spermatica contenant le sperme des mâles aissais. Peler le tissu du spermatique et isoler le sperme du tissu de la femelle à l’aide d’épingles à insectes. À l’aide d’un micro bloc à tarte, transférer le sperme dans un micro tube de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres d’un agent de refroidissement.
Incuber les échantillons de la reine F-zéro et le sperme à 95 degrés Celsius pendant 20 minutes. Flash centro fusionner le micro tube et stocker les échantillons à quatre degrés Celsius. Après avoir confirmé la production d’œufs par la reine F-one siv-mated, extraire l’ADN de la reine en utilisant les ailes hangar ou une jambe moyenne et génotype.
Ensuite, extraire l’ADN d’un mâle F-one en génotypage d’une jambe. Pour évaluer la fertilité des fourmis mâles des croisements consanguins, disséquez les organes reproducteurs internes dans un plat en verre avec 400 microlitres de solution PBS à l’aide de forceps. Retirez ensuite le PBS et remplacez-le par du paraformaldihyde à quatre pour cent à l’aide d’un tampon à tarte micro.
Fixer le tissu en incubant les échantillons dans PFA pendant quarante minutes à température ambiante. Après fixation, laver les tissus cinq fois avec 400 microlitres de PBS à l’aide d’un tampon à tarte micro. Diluer la solution DAPI à un milligramme par millilitre dans PBS.
Retirez le PBS et ajoutez environ 300 microlitres de la solution de coloration diluée DAPI au tissu. Incuber le tissu pendant 15 minutes dans des conditions sombres à température ambiante. Après l’incubation, lavez le tissu cinq fois avec 400 microlitres de PBS et transférez le tissu au centre d’une lame de verre à l’aide de forceps.
Montez ensuite le tissu sur le milieu de montage contenant de la tétraméthylrhodamine TRITC. Enfin, observez les échantillons à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal à l’aide des lentilles objectives 20 ou 60 3x. Les images microscopiques des testicules du mâle haploïde v Emeryi montrent le tissu fibreux sain ou le sperme qui sont absents dans diploid mâle v Emeryi, qui n’a pas montré le tissu fibreux sain.
Les organes reproducteurs mâles de Diploid mâle v Emeryi n’ont pas produit de sperme et leurs testicules ne se sont pas développés, ce qui suggère que les mâles produits dans les croisements consanguins sont stériles. Après son développement, cette technique nous a permis d’explorer la myatonie sexuelle dans une constante à Vollenhovia Emeryi pour les espèces de fourmis à chronométrage rapide.
