Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Molekularbiologie und genetischen Sphären von Hymenoptera zu beantworten, wie z. B. Sexualbestimmungssysteme. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir leicht Inzuchtlinien über die Ameise Vollenhovia Emery induzieren können, die für die genetische Kartierung und den molekularen Status unerlässlich sind. So kann diese Mission Einblick in das Geschlechtsbestimmungssystem einer bestimmten Ameise geben und sie kann auch auf andere Ameisen und andere Hymenoptera-Arten wie Wespen angewendet werden.
Um das Protokoll zu beginnen, sammeln V.Emeryi Kolonien im Frühsommer. Die Ameise von den gesammelten Ästen in ein künstliches Gipsnest mit einer Glasabdeckung mit einem Aspirator übertragen. Pflegen Sie die Kolonien im künstlichen Nest bei 25 Grad C, unter einem 16- bis achtstündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
Geben Sie Leitungswasser mit einer Waschflasche, um den Putz jeden zweiten Tag zur gleichen Zeit feucht zu halten. Als nächstes fügen Sie etwa 100 Mikrogramm trockenes Cricketpulver in Aluminiumfolie und eine braune Zuckerwasser gefüllte Spitze in die Kolonie, mit einer 20 Mikroliter Spitze jeden zweiten Tag, bis neue Fortpflanzungsameisen entstehen. Es ist wichtig, Mikrokolonien von den Feldern zu sammeln und ihnen genügend Nahrung zur Verfügung zu stellen, um neue Königinnen und Männchen zu gewinnen.
Verhindern Sie zunächst, dass sich Individuen bewegen, indem Sie Kolonien in einem Raum mit einer kontrollierten Umgebung platzieren, die 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius liegt. Entfernen Sie die Mittelbeine von 30 Arbeiterameisen mit Zangen unter einem Stereoskop, um die F-Null-Generation von den Arbeitern zu unterscheiden, die in nachfolgenden Inzuchtkreuzen produziert werden. Dann übertragen Sie die Ameisen in ein neues kleineres Gipsnest für Inzuchtkreuze.
Als nächstes fügen Sie drei bis vier Larven oder Pube in ein Gipsnest mit Arbeitern. Übertragen Sie eine langgeflügelte Königin und ein Männchen in ein zuvor vorbereitetes Gipsnest für Inzuchtkreuze. Für diesen Schritt ist es wichtig, die experimentelle Grenzkolonie im gleichen Zustand wie die einer normalen Kolonie zu erhalten.
Es ist schwierig, Inzucht zu induzieren, nur indem man Männchen und Weibchen zusammensetzt. Halten Sie die Kolonien bei 25 Grad Celsius unter einem 16 bis acht Stunden hellen, dunklen Zyklus mit Nahrung und Wasser zur Verfügung gestellt, bis die Königin ihre Flügel verliert und legt Eier. Überprüfen Sie die Versuchskolonie täglich unter einem Stereomikroskop.
Nach dem Aufstellen der Inzuchtkreuze zwischen den F-one-Nachkommen können Eier unter einem Stereoskop beobachtet werden. Nachdem die F-one-Königin beginnt, Eier zu legen, entfernen Sie die F-one Männchen und Larven oder Pube aus dem Nest, um zu verhindern, dass die F-one-Generation und die F-zwei-Generation mischen. Halten Sie die Kolonien unter den gleichen Bedingungen, bis die F-zwei Nachkommen entstehen.
Entfernen Sie ein Bein einer F-Null-Königin mit Zangen. Übertragen Sie das Bein in ein 1,5 Milliliter Mikrorohr mit 100 Mikrolitern eines Kühlmittels. Unter einem Stereoskop seziert ein weiblicher Bauch in einer Glasschale gefüllt mit 300 Mikroliter ultrareinem Wasser mit Zangen.
Dissimilieren Sie die Spermatica, die das Sperma von gepaarten Männchen enthält. Schälen Sie das Gewebe der Spermatica und isolieren Sie das Sperma aus dem Gewebe des Weibchens mit Insektenstiften. Übertragen Sie das Sperma mit einem Mikrokuchenpad in ein 1,5 Milliliter Mikrorohr, das 100 Mikroliter eines Kühlmittels enthält.
Inkubieren Sie die Proben von der F-Null-Königin und Spermien bei 95 Grad Celsius für 20 Minuten. Flash-Centro verschmelzen das Mikrorohr und lagern die Proben bei vier Grad Celsius. Nach der Bestätigung der Eiproduktion durch die siv-mated F-one Königin, extrahieren Sie die DNA der Königin mit den Schuppenflügeln oder einem Mittelbein und Genotyp.
Als nächstes extrahieren Sie die DNA eines F-one-Männchens, indem Sie ein Bein genotypisieren. Um die Fruchtbarkeit der männlichen Ameisen aus den Inzuchtkreuzen zu bewerten, sezieren Sie die inneren Fortpflanzungsorgane in einer Glasschale mit 400 Mikroliter PBS-Lösung mit Zangen. Entfernen Sie dann das PBS und ersetzen Sie es durch vier Prozent Paraformaldihyd mit einem Mikro-Kuchenpad.
Fixieren Sie das Gewebe, indem Sie die Proben in PFA für vierzig Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie das Gewebe nach der Fixierung fünfmal mit 400 MikroliterPBS mit einem Mikrokuchenpad. DAPI-Lösung auf ein Milligramm pro Milliliter in PBS verdünnen.
Entfernen Sie die PBS und fügen Sie dem Gewebe ca. 300 Mikroliter der verdünnten DAPI-Färbelösung hinzu. Inkubieren Sie das Gewebe für 15 Minuten unter dunklen Bedingungen eine Raumtemperatur. Waschen Sie das Gewebe nach der Inkubation fünfmal mit 400 Mikrolitern PBS und übertragen Sie das Gewebe mit Zangen in die Mitte einer Glasrutsche.
Dann montieren Sie das Gewebe auf montagemedium mit TRITC Tetramethylrhodamin. Beobachten Sie schließlich die Proben mit einem konfokalen Laserscanmikroskop mit den 20 oder 60 3x Objektiven. Mikroskopische Bilder von Hoden von Haploid männlich v Emeryi zeigen gesundes faseriges Gewebe oder Spermien, die in Diploid männlich v Emeryi fehlen, die nicht gesundes faseriges Gewebe zeigten.
Die männlichen Fortpflanzungsorgane von Diploid männlich v Emeryi produzierten keine Spermien und ihre Hoden entwickelten sich nicht, was darauf hindeutet, dass Männchen, die in Inzuchtkreuzen produziert werden, steril sind. Nach seiner Entwicklung ebnete uns diese Technik den Weg, um Sexmyatonie in einer Konstante in Vollenhovia Emeryi für die schnelle Timing-Ameise zu erforschen.
