Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в молекулярной биологии и генетической сфере Hymenoptera, такие как системы определения пола. Основным преимуществом этой техники является то, что мы можем легко вызвать инбридинг линий над муравьем Vollenhovia Эмери, которые необходимы для генетического картирования и молекулярного статуса. Таким образом, эта миссия может дать представление о системе определения пола конкретного муравья, и она также может быть применена к другим муравьям и другим видам гименоптеры, таким как осы.
Чтобы начать составление протокола, соберите колонии В.Эмери в начале лета. Перенесите образцы муравьев из собранных ветвей в искусственное гипсовое гнездо со стеклянной крышкой с помощью аспиратора. Поддерживайте колонии в искусственном гнезде при 25 градусах Цельсия, в течение 16-8 часов светло-темного цикла.
Обеспечить водопроводную воду с мытья бутылки держать штукатурку влажной через день в то же время. Далее, добавить около 100 микрограммов сухого порошка крикет завернутый в алюминиевую фольгу и коричневый сахар воды заполненные отзыв в колонию, используя 20 микролитер отзыв через день, пока новые репродуктивные муравьи появляются. Важно собирать микро колонии с полей и обеспечить их достаточным питанием, чтобы получить новых королев и самцов.
Во-первых, остановить людей от перемещения, поместив колоний в комнате с контролируемой средой, установленной на четыре градуса по Цельсию в течение 15 минут. Удалите средние ноги 30 рабочих муравьев, используя типсы под стереоскопом, чтобы отличить поколение F-zero от рабочих, произведенных в последующих инбридинговых крестах. Затем перенесите муравьев в новое меньшее гипсовое гнездо для инбридинга крестов.
Затем добавьте три-четыре личинки или лобок в гипсовое гнездо, содержащее рабочих. Перенесите длиннокрылую королеву и самца в ранее подготовленное гипсовое гнездо для инбридинга крестов. Для этого важно поддерживать экспериментальную переправу в том же состоянии, что и обычная колония.
Трудно вызвать инбридинг только путем размещения мужчин и женщин вместе. Держите колонии на 25 градусов по Цельсию под 16 до 8 часов света, темный цикл с пищей и водой, пока королева теряет крылья и откладывает яйца. Проверьте экспериментальную колонию каждый день под стерео микроскопом.
После установки инбридинговые кресты между потомками F-one, яйца можно наблюдать под стереоскопом. После F-один королева начинает откладывать яйца, удалить F-один мужчин и личинок или лобок из гнезда, чтобы предотвратить F-одно поколение и F-два поколения от смешивания. Держите колонии в тех же условиях, пока F-два потомства возникают.
Удалите одну ногу F-нулевой королевы с помощью хлипов. Перенесите ногу в микротрубку на 1,5 миллилитра, содержащую 100 микролитров холодиллера. Под стереоскопом вскрыть женский живот в стеклянной тарелке, наполненной 300 микролитров ультра чистой воды с помощью типсов.
Отличается сперматика, содержащая сперму от спариваемых самцов. Очистите ткань сперматики и изолируйте сперму из тканей самки с помощью булавок насекомых. Используя микро-пирог площадку, передать сперму в 1,5 миллилитров микро трубки, содержащей 100 микролитров холодильного агента.
Инкубировать образцы из F-нулевой королевы и спермы при 95 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Flash centro сливает микротрубку и хранит образцы при четырех градусах Цельсия. После подтверждения производства яиц сив-мэт F-один королева, извлечь ДНК королевы с помощью крыльев сарая или одной средней ноги и генотипа.
Затем извлекайте ДНК самца F-one, генотипив одну ногу. Для оценки плодовитости мужских муравьев из инбридинг крестов, вскрыть внутренние репродуктивные органы в стеклянной тарелке с 400 микролитров раствора PBS с помощью типсов. Затем удалите PBS и заменить его на четыре процента параформальдигида с помощью микро пирог площадку.
Исправить ткани путем инкубации образцов в PFA в течение сорока минут в комнатной температуре. После фиксации, мыть ткани пять раз с 400 микролитров PBS с помощью микро пирог площадку. Разбавить решение DAPI до одного миллиграмма на миллилитр в PBS.
Удалите PBS и добавьте около 300 микролитров разбавленного раствора окрашивания DAPI в ткань. Инкубировать ткань в течение 15 минут в темных условиях комнатной температуры. После инкубации, мыть ткани пять раз с 400 микролитров PBS и передачи ткани в центр стеклянной горки с помощью миппов.
Затем смонтировать ткань на монтажной среде, содержащей триТЦ тетрапетилрозодамин. Наконец наблюдать образцы с конфокального лазерного сканирования микроскопа с помощью 20 или 60 3x объективных линз. Микроскопические изображения яисков гаплоидных самцов v Emeryi показывают здоровую волокнистую ткань или сперму, которые отсутствуют в Diploid male v Emeryi, которые не показали здоровую волокнистую ткань.
Мужские репродуктивные органы Diploid male v Emeryi не производили сперму, и их яички не развивались, что говорит о том, что самцы, образуются в инбридинг-крестах, стерильны. После его развития, эта техника проложила путь для нас, чтобы исследовать секс myatony в постоянной в Vollenhovia Эмерии для быстрого времени муравьев видов.
