المؤلفان بالشكر NSF (MCB-1157876) للحصول على التمويل. كما نشكر البرتو سيفتا، جون Roote، واثنين من الحكام المجهولين على تعليقاتهم.

يجب أن يتم تنفيذ التجارب على نطاق صغير لتصبح مألوفة مع الإجراء بأكمله. 1. جمع إناث والذكور العذراء السذاجة أبسط نسخة من التجربة المذكورة تتكون من أربعة أنواع من الصلبان الأولية، التي تنطوي على التركيبة التالية من البالغين: أ) W الأفراد 1118 من أجل جمع الإناث عذراء؛ ب) الأفراد أوريغون-R من أجل جمع الذكور إشارة ساذجة؛ ج ) P {} SW الذكور والإناث متماثلة اللواقح عذراء من خط السيطرة الذي يحمل المنظمة من النوع البري من SDIC من أجل جمع الذكور التجريبية السذاجة (النوع الأول)، ود) P {} SW الذكور متماثلة اللواقح وSDIC-SW-الحذف التي تحمل الإناث العذراء من أجل جمع الذكور التجريبية الساذجة التي تحمل نقص SDIC-SW (النوع الثاني). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قوارير متعددة تحتوي على 8-10 إناث و 5 ذكور لكل منهما. السماح للإناث لوضعالبيض ونقل أشخاص إلى قارورة جديدة كل 3-5 أيام. استخدام زجاجات بدلا من قوارير إذا لزم الأمر، ودائما استخدام المواد الغذائية الطازجة. وعدد من قوارير المطلوبة تعتمد على عدد من أنواع ذكر التجريبية قيد الدراسة وعدد من الأفراد يقدر أن يكون من الضروري كشف الفروق (الجدول 1). أكثر من 10 من الإناث في قارورة قد تؤدي إلى الإفراط في الازدحام خلال نمو اليرقات، والتي قد تسبب التباين في خصوبة النسل. قارورة مخزن عند 25 درجة مئوية في غرفة التحكم في درجة حرارته. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البدء في جمع الإناث والذكور عذراء ساذجة في الأيام ال 11 و 12 ال بعد إعداد الصلبان الأولي. فترة الانتظار تتغير وفقا لدرجة الحرارة، وانخفاض درجات الحرارة في نتيجة قتا أطول التنموية تأخير مجموعة من الأفراد. وثمة عامل آخر يؤثر على توقيت لeclosion هو نوع من المتوسط. الطعام المغذي، مثل دقيق الذرة متوسطة-29 الخميرة، ويؤكد تطور السليم للبالغينالجهاز التناسلي، مما يسهل التزاوج. جمع unmated تطير كل 4-6 ساعة. عندما جمع، تخدير الذباب عن طريق إدخال CO 2 في قارورة، والاستفادة من الذباب إلى أسفل، والجنس منهم تحت stereomicroscope (الشكل 2). وضع الذباب المطلوب في قوارير مختلفة حسب الجنس والنمط الظاهري وتسمية قارورة بشكل مناسب. </li></ol> ملاحظة 1. يبدأ روتين جمع في الصباح قبل التخلص من البالغين التي برزت خلال الليلة السابقة. جمع الإناث والذكور العذراء السذاجة مرة واحدة أو مرتين خلال النهار. عادة، D. الذكور البطن تصبح ناضجة جنسيا 8 ساعة بعد eclosion عند 25 ° C 30. إذا تمسك الذباب تحت 12:12 ساعة الضوء / الظلام دورات، ومن المتوقع قمتين من eclosion: خلال ساعة الأولى 1-2 بعد تشغيل الضوء على، وخلال ساعة 2 قبل تشغيل ضوء قبالة. يحدث في غضون 24 ساعة Eclosion بعد يظلم خادرة. ملاحظة 2. لا يزيد عن 10 من الإناث SHتوضع ولد في نفس القارورة لمنع الإفراط في الازدحام. هذا يحد أيضا من فقدان للإناث في حالة لديهم ليتم التخلص منها لأن واحدا منهم على الاقل ليس العذراء. ملاحظة 3. من أجل جمع العدد المناسب من الإناث والذكور عذراء ساذجة في فترة زمنية قصيرة، ويمكن اعتماد التدابير التالية. إعداد قنينة من 15-20 ث 1118 لإجراء التجارب التي تنطوي على نوعين من الذكور التجريبية (الجدول 1). رش بخفة على سطح وسائل الإعلام وإضافة بضع المجففة الكريات الخميرة نشطة لتسهيل وضع البيض. نقل الآباء على الأقل 4 مرات في أيام متتالية. لزيادة السطح المتاحة للالتشرنق في كل قارورة، إدراج ورقة متعددة مطوية (7 × 5 سم) خلال اليوم الخامس عشر 4 أو 5 بعد يتم تحويل الآباء إلى قارورة أخرى (الشكل 3). وإذا كان عدد البالغين خرجت من الصلبان الأولي لا يكفي، والانتظار لبضعة أيام وجمع األفرادALS من القنينات التي أقيمت في تواريخ مختلفة. خطة لتنفيذ التجارب على مدى عدة أيام متتالية حتى خارج عبء العمل. 2. تجارب نقرا مزدوجا التزاوج ويبين الشكل 4 خطوات الرئيسية التي تشارك في التجارب نقرا مزدوجا التزاوج التي أجريت في 14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح يوم 1، إعداد التزاوج الأول. الذكور أوريغون-R هي أول لزميله في مقايسة جريمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الشافطة، إعداد قارورة تحتوي على 10 أبيض العينين ث الإناث عذراء 1118 4-5 يوما و 10 أحمر العينين أوريغون-R الذكور السذاجة لكل منهما. يتم تعيين اثنين إلى ثلاثة قوارير تصل يوميا لمدة 5 أيام متتالية. قد تختلف عدد القنينات التي ستنشأ اعتمادا على عدد من الأفراد المتاحة. السماح للذباب لزميله لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الذكور أوريغون-R وتضع كل أنثى في قارورة جديدة باستخدام الشافطة (الشكل 5). لا يمكن أن يتحقق تحديد الجنس عن طريق التفتيش البصري من عدد قليل منالاختلافات المورفولوجية (الشكل 2). تسمية كل قارورة بشكل مناسب وترك الأنثى في قارورة لمدة 2 يوم (الآخرة &quot;V1&quot;). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3، وإعداد التزاوج الثاني. يجب أن يتم تنفيذ مجموعة من الذكور وعبر إعداد عشوائيا من أجل تقليل أي تحيز محتمل تجاه أي من أنواع ذكر التجريبية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل ساعتين من تشغيل ضوء قبالة، ونقل مرة أخرى الأنثى إلى قارورة جديدة مع الشافطة. تسمية القارورة الجديدة بشكل مناسب (الآخرة &quot;V2&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعرض ثلاثة ذكور التجريبية 5-6 أيام من العمر من نفس النمط الجيني إلى V2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر 2.2.1 و 2.2.2 لكل أنثى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 4، ساعتين الحق قبل ضوء في وضع التشغيل (أي ما لا يزيد عن 12 ساعة بعد 2.2.1)، وتجاهل الذكور باستخدام الشافطة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 6، ونقل كل أنثى مرة أخرى إلى قارورة أخرى جديدة. تسمية قارورة جديدة بشكل مناسب (الآخرة &quot;V3&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 10، وتجاهل 1118 ث </سوب الإناث&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة السلالات في V2 و v3. يتم تنفيذ عملية التفتيش الأولى بعد 13-15 يوما بعد أن يتم إدخال الأنثى في V2 (أو V3)، على سبيل المثال في يوم 17 بعد أول امرأة في ovipositing بدأت في V2. يتم تنفيذ عملية التفتيش الثانية بالضبط بعد 17 يوما. هذا الإطار الزمني يشكل الحدود الزمانية العلوي آمن يضمن أي الجيل الثاني في نفس القارورة. عمليتي تفتيش منع الإفراط في الازدحام مع تسهيل العد ذرية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 17، وفحص V1 وضمان عدم وجود ذرية أحمر العينين الحاضر، وإذا كان لا علامة القارورة وفقا لذلك. جود ذرية بيضاء العينين يشير إلى أن الإناث لم يكن عذراء في وقت التزاوج الأولي في حين لا ذرية يشير إلى أن التزاوج مع الإشارة أو الذكور التجريبية لم يحدث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 17، نفذ أول عملية تفتيش من V2. ظهرت تخدير ذرية في V2 مع CO 2 وفرزها حسب اللون العين والجنس. أرقام ذرية سجل أنجب من الأولى والثانيةالذكور أندو. الشكل 6 يبين الظواهر المتوقعة في ذرية من كل مخطط التزاوج. في هذه التجربة 14 خاصة، فقط ذرية الإناث يمكن تعيين بشكل لا لبس فيه كما انجب من الإشارة أو الذكور التجريبية، وبالتالي فقط على المعلومات من بنات يمكن استخدامها لحساب P 2. إذا مع علامات أخرى في أبوة ذرية من الذكور يمكن تعيين بشكل لا لبس فيه، التهم ذرية من كلا الجنسين يمكن استخدامها في العمليات الحسابية المصب. تجاهل ذرية ولكن يبقى V2 للتفتيش الثاني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 20، والمضي قدما كما هو الحال في 2.5.2 مع السلاله ظهرت حديثا في V2 ثم تجاهل القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 20، وفحص ذرية ظهرت في V3 للمرة الأولى واتبع الخطوة 2.5.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 23، والمضي قدما كما هو الحال في 2.5.3 مع السلاله ظهرت حديثا في V3. </li></ol></li></ol> ملاحظة 1: ونظرا لتأثير محتمل على تضخيم عشرات P أن التزاوج متعددة قد يكون (2.2.2 و 2.2.3)، التزاوجيمكن أن تقتصر على فترة زمنية معينة. والإطار الزمني تعتمد على تردد remating المرتبطة النمط الجيني للإناث والذكور المستخدمة. يتم تقليل احتمال التزاوج متعددة خصيصا من مرة خلال الليل 11. ملاحظة 2: لا تقم بإضافة حبيبات الخميرة الحية لأن هذا قد يسبب مشاكل بسبب فرط المحتملة من الخميرة عندما يكون عدد الذباب الكبار منخفضة. 3. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي تنظيم التهم ذرية سجلت مناسب للتفتيش البصرية سهل والتحليل كفاءة مع الحزمة الإحصائية المناسبة (مثل أحزاب اللقاء المشترك من معهد SAS) أو أدوات مجانية على شبكة الإنترنت (على سبيل المثال <a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القدرة التنافسية الحيوانات المنوية. أضف التهم من V2 و v3. الذباب الإناث التي أدت إلى ما لا أو محدودة جدا ذرية (على سبيل المثال &lt;10)، توفي أثناء إجراء، أو كانت بنجاح إلا inseminaتعتبر تيد من قبل واحدة من الذكور اثنان على أنها غير مفيدة ومستثناة من أي تحليل إحصائي المصب (2.5.1 والجدول 2). حساب P 2 درجة لكل أنثى بالمعلومات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار ما إذا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية في القيم P 2 بين الذكور التجريبية مقارنة. ويمكن القيام بذلك باستخدام حدودي (HSD مثل توكي) أو غير المعلمية الاختبارات (مثل الصلب Dwass) اعتمادا على عدة عوامل بما في ذلك عن أي انحراف في توزيع القيم P 2 والتبعية بين التباين والمتوسط. يتم تطبيق التحول الزاوي عادة إلى أبعاد مثل P 2 قبل استخدام الاختبارات المعلمية 31. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختلافات معدل التزاوج (اختياري). لكل نوع من الذكور التجريبية، وحساب عدد الإناث تزاوج على نحو مضاعف، وتلك التي تزاوج فقط مع ذكر الأول (ذكر مرجع في مقايسة الجرم وذكر التجريبية في دefense مقايسة). باستخدام اختبار ثنائي الطرف فيشر الدقيق (متوفر في <a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">http://www.langsrud.com/fisher.htm</a> )، وتحديد ما إذا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين هذين النوعين من الذكور التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسبة الجنس (اختياري). لكل من الذكور التجريبية، استخدم اختبار خي مربع لتحديد ما إذا كانت النسبة بين الجنسين في ذرية من كل ينحرف أنثى من نسبة 1:1 المتوقعة. </li></ol>

<ol>
	<li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The descent of man and selection in relation to sex. , (1871).</li><li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects.">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).</li><li>Birkhead, T. R., M&#248;ller, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm competition and sexual selection. , (1998).</li><li>Jones, B., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+sperm+competition+estimates.">Bayesian sperm competition estimates.</a> Genetics. 163, 1193-1199 (2003).</li><li>Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+and+sperm+displacement+in+natural+populations+of+Drosophila+melanogaster.">Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster.</a> Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).</li><li>Jonsson, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+transfer,+storage,+displacement,+and+utilization+in+Drosophila+melanogaster.">Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 47, 1719-1736 (1962).</li><li>Boorman, E., Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+(ejaculate)+competition+in+Drosophila+melanogaster,+and+the+reproductive+value+of+females+to+males+in+relation+to+female+age+and+mating+status.">Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status.</a> Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).</li><li>Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. , 372-427 (1984).</li><li>Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+sperm+displacement+and+its+association+with+accessory+gland+protein+loci+in+Drosophila+melanogaster.">Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 139, 189-201 (1995).</li><li>Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+x+male+interactions+in+Drosophila+sperm+competition.">Female x male interactions in Drosophila sperm competition.</a> Science. 283, 217-220 (1999).</li><li>Civetta, A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+effects+on+male+and+female+components+of+sperm+precedence+in+Drosophila.">Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila.</a> Genet. Res. 75, 143-151 (2000).</li><li>Greenspan, L., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+variation+in+X+chromosome+male+reproductive+genes+and+sperm+competitive+ability+in+Drosophila+melanogaster.">Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster.</a> Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).</li><li>Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+male+accessory+gland+protein+Acp36DE+in+sperm+competition+in+Drosophila+melanogaster.">The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).</li><li>Yeh, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evidence+that+a+recently+evolved+Drosophila+sperm-specific+gene+boosts+sperm+competition.">Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).</li><li>Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+multiple+kinds+of+female+sperm-storage+organs+in+Drosophila.">Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila.</a> Evolution. 53, 1804-1822 (1999).</li><li>Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ejaculate-female+coevolution+in+Drosophila+mojavensis.">Ejaculate-female coevolution in Drosophila mojavensis.</a> Proc. Biol. Sci. 270, 1507-1512 (2003).</li><li>Nonidez, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+phenomenon+of+reproduction+in+Drosophila.">The internal phenomenon of reproduction in Drosophila.</a> Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).</li><li>Miller, G. T., Pitnick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-female+coevolution+in+Drosophila.">Sperm-female coevolution in Drosophila.</a> Science. 298, 1230-1233 (2002).</li><li>Manier, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+mechanisms+of+competitive+fertilization+success+in+Drosophila+melanogaster.">Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster.</a> Science. 328, 354-357 (2010).</li><li>Simmons, L., Siva-Jothy, M., Birkhead, T. R., M&#248;ller, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm competition and sexual selection. , 826 (1998).</li><li>Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+remating,+sperm+competition+and+sexual+selection+in+Drosophila.">Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila.</a> Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).</li><li>Markow, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+investigation+of+the+mating+system+of+Drosophila+hydei.">A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei.</a> Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).</li><li>Barbadilla, A., Quezada-D&#237;az, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+history+of+Drosophila+buzzatii.+XVII.+Double+mating+and+sperm+predominance.">The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance.</a> Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).</li><li>Civetta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+sperm+competition+and+sperm+storage+in+Drosophila.">Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila.</a> Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).</li><li>Turner, M. E., Anderson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+predominance+among+Drosophila+pseudoobscura+karyotypes.">Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes.</a> Evolution. 38, 983-995 (1984).</li><li>Harshman, L. G., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inference+of+sperm+competition+from+broods+of+field-caught+Drosophila.">Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila.</a> Evolution. , 1334-1341 (1998).</li><li>Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+in+wild+Drosophila+melanogaster+revisited+by+microsatellite+analysis.">Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis.</a> Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).</li><li>Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+between+Drosophila+males+involves+both+displacement+and+incapacitation.">Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation.</a> Nature. 400, 449-452 (1999).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly+Pushing:+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics.">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics.</a> , (1997).</li><li>Sokal, R. R., Rohlf, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , (1994).</li><li>Clark, A. G., Begun, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+genotypes+affect+sperm+displacement+in+Drosophila.">Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila.</a> Genetics. 149, 1487-1493 (1998).</li><li>Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontransitivity+of+sperm+precedence+in+Drosophila.">Nontransitivity of sperm precedence in Drosophila.</a> Evolution. 54, 1030-1035 (2000).</li><li>Wigby, S., Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition.">Sperm competition.</a> Curr. Biol. 14, 100-102 (2004).</li><li>Pizzari, T., Parker, G. A., Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm biology: an evolutionary perspective. , 674 (2008).</li><li>Ram, K. R., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminar+influences:+Drosophila+Acps+and+the+molecular+interplay+between+males+and+females+during+reproduction.">Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction.</a> Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).</li><li>Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+sperm+competition+and+sperm+competition+avoidance+in+Drosophila+melanogaster.">Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وصفناها التصميم التجريبي لتقييم الاختلافات في المساهمة النسبية متميزة وراثيا D. الذكور البطن إلى ذرية في التجارب التي تسيطر عليها نقرا مزدوجا التزاوج 7،8. وقد تم ذلك في سياق العامل الوراثي الافتراض للتأثير على القدرة التنافسية الحيوانات المنوية، وقد ...

منذ احظت جيف باركر انتشار المنافسة الحيوانات المنوية في الحشرات وآثارها التطوري 2، وقد حاول موجة من الدراسات في ذبابة الفاكهة وغيرها من الأنواع لتسليط بعض الضوء على هذه الظاهرة في العديد من المستويات المختلفة. وكانت بعض الأمثلة من المجالات ذات الاهتمام المسح من التباين في العشائر الطبيعية 9،10، هندسته المعمارية الجينية وأهمية العوامل الوراثية الكامنة وراء 11-14، ودورها في دفع عجلة التطور المشترك بين الجنسين 15،16. في D. البطن الإناث، والقدرة المحدودة للأجهزة تخزين الحيوانات المنوية المتخصصة، وزوج من spermatheca وعاء المنوي 6،17، ويساهم في المنافسة من الحيوانات المنوية من الذكور مختلفة. يتم نقل ما يقرب من 1،500 الحيوانات المنوية أثناء التزاوج إلى أنثى ولكن فقط ~ 500 يمكن استيعابها في الأجهزة المذكورة 18،19. في المختبر، التي تسيطر عليها نقرا مزدوجا التزاوج التجاربالإدلاء بالبيانات التي تنطوي على ذكر مرجع واحد أو أكثر من الذكور من الفائدة التي استخدمت على نطاق واسع لتقييم القدرة التنافسية الحيوانات المنوية 7،8. ويقدر قدرة تنافسية الحيوانات المنوية ونسبة ذرية انجب من الذكور التجريبية في التجارب نقرا مزدوجا التزاوج على ذرية المجموع، أي أن كلا من الذكور التجريبية والمرجعية. يتألف القدرة التنافسية الحيوانات المنوية عنصرين، كل واحد منهم تقييمها في فحص منفصلة. في مقايسة جريمة، وقدرة الحيوانات المنوية من الذكور التجريبية لتهجير الحيوانات المنوية من الرجال أولا، أي ذكر مرجع، يتم تقييمها. وعلى العكس، في مقايسة الدفاع، وقدرة الحيوانات المنوية من الذكور التجريبية لمقاومة النزوح أو للحد من نجاح الإخصاب من الحيوانات المنوية من الذكور المرجعية وتقييمها. اعتمادا على نوع من الفحص، والدفاع أو جريمة، ويقدر قدرة الحيوانات المنوية التنافسية من خلال عشرات P 1 أو P 2، على التوالي. P1 و P 2 لا يمكن إلا أن تأخذ القيم بين 0 و 1. عادة ما يتم تفسير القيم المتوسطة كدليل غير مباشر من الحيوانات المنوية الاختلاط، الذي يشير إلى وجود سيناريو الفسيولوجية التي تنطوي على منافسة الحيوانات المنوية مباشرة. باتباع نفس المنطق، يمكن تفسير القيم المتطرفة كدليل قوي لقدرة الحيوانات المنوية الفرق المنافسة. وأظهرت الدراسات المبكرة التي P 2 في D. البطن هو أكثر من 0.8 زيادة عن الوقت المنقضي بين اثنين من التزاوج يطيل 7. وقد استخدم نفس هذا التصميم التجريبي في ذبابة الفاكهة الأنواع الأخرى، P 2 يجري إحصاء التي يشيع استخدامها في دراسات لتقييم الحيوانات المنوية القدرة التنافسية 20. بالنسبة لمعظم الأنواع، وP القيم 2 من سلالات اختبار أعلى من 0.6 21. ومع ذلك، يمكن أن عدة آليات أخرى لا علاقة لها منافسة مباشرة بين الحيوانات المنوية من الذكور مختلفة يسفر عن عشرات متطابقة (انظر المناقشة). Dذرية istinguishing انجب من الذكور الأول أو الثاني هو ممكن من خلال استخدام علامات يسهل التعرف عليها. في الدراسات في وقت مبكر، وكان المشع واحد من الذكور في جرعات شبه مميتة، على سبيل المثال، الأشعة السينية مثل أن جميع البويضات المخصبة بواسطة الحيوانات المنوية المشع فشل ليفقس 7. وفي وقت لاحق، كانت الطفرات تغيير تصبغ العين أو شكل الجناح علامات الأكثر استخداما. أمثلة من السابق هي طفرات من وزن الجسم (البني) 9، CN (الزنجفر) 22 و W (أبيض) 23، في حين أن الطفرات قبرصي (مجعد) 24 يتوافق مع نوع الثاني من الظواهر، وقد تم الجمع بين بعض هذه الطفرات في نفس الشخص، على سبيل المثال CN وزن الجسم. وإلى حد أقل، إنزيمات متغايرة جينيا 25 و 26،27 الصغرية مع أنماط الميراث معروفة استخدمت أيضا. التصميم التجريبي لاختبار الفروق فيالقدرة التنافسية الحيوانات المنوية وصفها هنا يتبع أساسا أن من كلارك وآخرون. 9. النتائج المستمدة من هذه التجارب تعطي معلومات فقط حول أبوة الفرق من أنواع ذكر التجريبية تحت المجهر. المقايسات التي تجعل أيضا بدل عن الاختلافات بعد الإخصاب في اللياقة البدنية 14،28 وتقنيات التصور الحيوانات المنوية 24 تمكين الاختلافات في P 1 (أو P 2) يسجل أن تفسر على أنها اختلافات في اختصاص الحيوانات المنوية. الشكل 1 يبين الأساس المنطقي لكل من الجرم والمقايسات الدفاع. لتوضيح اللوجستية للعملية، نفذت تجربة جريمة في D. البطن 14 سيتم شرحها بالتفصيل. وقد استخدم هذا الاختبار جريمة معينة لاختبار للحصول على تأثير يمكن قياسه من عائلة متعددة الجينات الحيوانات المنوية محددة سلسلة وسيطة داينين ​​(SDIC) على القدرة التنافسية الحيوانات المنوية. كل الأعضاءق من هذه العائلة متعددة الجينات الموجودة جنبا إلى جنب على الكروموسوم X. وقد تم توليد الذكور بالضربة القاضية بحذف الكتلة SDIC. لأن الجزء حذف شملت أيضا الجناح قصيرة الجينات الأساسية (SW) وكان الغرض من هذه الدراسة هو تقييم أهمية SDIC، تم انقاذ الذكور تحمل الحذف SDIC-SW بنسخة معدلة وراثيا من SW (يرمز كما P {SW} ، التي حملت أيضا مراسل الجين صغيرة بيضاء) على كروموسوم 2. وقد استخدم لون العينين كعلامة مرئية لتحديد الأبوة. كانت كل الذباب في خلفية متحولة الأبيض مع استثناء من تلك السلالة من ولاية أوريغون-R، والتي كانت تستخدم لذكور المرجعية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amber latex tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62996-473</td>
			<td>1/4 inch ID, 1/6 inch Wall</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml graduated XL filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mesh Fabric</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thin and smooth</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td>Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FlyStuff Foot Valve, complete system</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121C</td>
			<td>Not necessary if FlyNap is used</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Come with carboard trays that can be reused for holding vials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-212</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Active dry yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td>Found in general grocery store</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Different colors may be used for marking different genotypes</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

assessing differences in sperm competitive ability in drosophila

المنافسة بين الذكور مناوع لتخصيب البويضات هي واحدة من آليات الانتقاء الجنسي، أي التحديد التي تعمل على تعظيم عدد من الأحداث التزاوج الناجح بدلا من البقاء على قيد الحياة على تعظيم وقدرتها على البقاء 1. المنافسة الحيوانات المنوية يمثل التنافس بين الذكور بعد التزاوج مع نفس الأنثى 2، التي هي من قبيل الصدفة السائل المنوي لديهم في الزمان والمكان. تم الإبلاغ عن هذه الظاهرة في أنواع متعددة من النباتات والحيوانات 3. على سبيل المثال، المصادة D. تحتوي على الإناث البطن عادة الحيوانات المنوية 2-3 الذكور 4. يتم تخزين الحيوانات المنوية في الهيئات المتخصصة مع قدرة تخزين محدودة، والتي قد تؤدي إلى منافسة مباشرة من الحيوانات المنوية من الذكور 2،5 مختلفة. مقارنة القدرة التنافسية الحيوانات المنوية من الذكور مختلفة من الاهتمام (أنواع الذكور التجريبية) قد أنجز من خلال رقابة التجربه انقر نقرا مزدوجا التزاوجTS في المختبر 6،7. لفترة وجيزة، تتعرض امرأة واحدة لاثنين من الذكور مختلفة على التوالي، ذكر تجريبية واحدة واحدة عبر التزاوج إشارة الذكور. ثم يتبع نظام التزاوج نفسه باستخدام أنواع أخرى ذكر التجريبية مما يسهل المقارنة غير المباشرة من القدرة التنافسية للالسائل المنوي لديهم من خلال مرجعية مشتركة. يتم التعرف على جزء صغير من الأفراد يولدون من التجريبية والمرجعية الذكور باستخدام علامات، الذي يسمح احد لتقدير القدرة التنافسية الحيوانات المنوية باستخدام تعبيرات حسابية بسيطة 7،8. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تقدير القدرة التنافسية الحيوانات المنوية في اثنين من سيناريوهات مختلفة اعتمادا على ما إذا كان الذكور التجريبية هو الثاني أو الأول لزميله (جريمة وفحص الدفاع، على التوالي) 9، والذي يفترض أن يكون معبرا من سمات اختصاص مختلفة. هنا، نحن تصف النهج الذي يساعد على استجواب دور العوامل الجينية المختلفة التي تكمن وراء مزعومة رانه ظاهرة القدرة التنافسية الحيوانات المنوية في D. البطن.

يلخص الجدول 2 بعض السمات البارزة لتجربتين جريمة (فحوصات 1 و 2) التي D. تتم مقارنة البطن الذكور التجريبية مع وبدون (النوع الأول والثاني، على التوالي) كتلة SDIC الوظيفية 14. بعد الأخذ في الاعتبار حالات مختلفة واجهتها مع بعض مكررات، تم العثور على 5...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila at JoVE.com

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

الفرق الحيوانات المنوية القدرة التنافسية بين<em&gt; ذبابة الفاكهة</emيمكن&gt; الذكور مع الأنماط الوراثية متميزة التأكد من خلال تجارب نقرا مزدوجا التزاوج. كل من هذه التجارب تنطوي على واحد من الذكور من الفائدة وذكر المرجع. علامات التعرف عليها بسهولة في ذرية تسمح الاستدلال من جزء صغير من الأفراد يولدون من كل ذكر.

تقييم الاختلافات في القدرة التنافسية في الحيوانات المنوية<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

assessing-differences-in-sperm-competitive-ability-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

14.5K Views.  University of California, Irvine. الفرق الحيوانات المنوية القدرة التنافسية بين ذبابة الفاكهة الذكور مع الأنماط الوراثية متميزة التأكد من خلال تجارب نقرا مزدوجا التزاوج. كل من هذه التجارب تنطوي على واحد من الذكور من الفائدة وذكر المرجع. علامات التعرف عليها بسهولة في ذرية تسمح الاست?...

Video: Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

تقنيات التصوير كاليفورنيا 2 + في اشارة الى الحيوانات المنوية البشرية

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

والعزلة في المختبر تفعيل انواع معينة ايليجانس الحيوانات المنوية

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

تصور وتتبع mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية Drosophila الميلانوجاستر البيض

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

الإنتاجية المتوسطة فحص فحوصات لتقييم الآثار على Ca2 +-إشارات ورد فعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

تقييم القدرة Phagocytic العمر محددة من الكبار دروسوزيلا الهيموسيات الميلانوغاستر باستخدام في فيفو الفاتن الدمج

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

تشريح وإصلاح وتصور ذبابة الفاكهة العذراء Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...