يتم استخدام هذا البروتوكول لتحديد حجم الحضنة والصلاحية الجنينية من قبل العديد من مختبرات C.elegans. يمكن أن يشير الانخفاض في الحجم الغاشم والصلاحية الجنينية إلى وجود عيوب في العمليات التنموية المهمة مثل العضل والإخصاب والتطور الجنيني. توفر هذه التقنية تعليمات واضحة للباحثين المبتدئين في C.elegans.
من السهل نسبيا إعداده وتنفيذه ، وهو نقطة انطلاق رائعة عند العمل مع سلالات متحولة جديدة. التحدي الأكبر لهذه التقنية هو تحديد الجنين مقابل تحديد الجنين غير المخصب. يجب على الباحثين الجدد التدرب على تحديد الأجنة والبويضات ومراحل اليرقات المختلفة قبل البدء في هذه التجارب.
للبدء ، قم بتسمية الجزء الخلفي من اللوحة ، وانقل خنثى مرحلة L4 الفردية إلى اللوحة. تأكد من عدم نقل أي أجنة أو ديدان أخرى إلى اللوحة. اسمح للديدان بالتطور إلى بالغين ووضع ذرية ذاتية لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة الاستزراع القياسية البالغة 20 درجة مئوية.
سجل اللوحة في اليوم الثالث. في اليوم التالي ، قم بتسمية مجموعة من اللوحات الجديدة وانقل اليوم دودة فردية واحدة إلى اللوحة الجديدة. اسمح للديدان بوضع الأجنة لمدة 24 ساعة عند 20 درجة مئوية.
سجل اللوحة في اليوم الرابع. في اليوم الثالث ، قم بتسمية مجموعة من اللوحات الجديدة وانقل الديدان الفردية في اليوم الثاني إلى اللوحة الجديدة. اسمح للديدان بوضع ذرية لمدة 24 ساعة عند 20 درجة.
سجل اللوحة في اليوم الخامس. ارسم نمطا شبكيا على غطاء 35 ملم باستخدام علامة دقيقة. ضع الغطاء الشبكي أسفل لوحة الاختبار للعد لتتبع الديدان التي تم عدها مسبقا.
باستخدام عداد الخلايا التفاضلية ، عد اليرقات الحية والأجنة غير المفقسة داخل المربع الفردي. بالنسبة للديدان على الحدود المربعة ، عد على أساس موقع رأس الدودة. عد الديدان برؤوس تلامس الحواف العلوية واليسرى للمربع.
سجل عدد اليرقات الحية والأجنة غير المفرغة في دفتر ملاحظات المختبر. في اليوم الرابع ، سجل لوحة اليوم الثاني عن طريق عد اليرقات الحية والأجنة غير المفقسة وسجلها في دفتر ملاحظات في المختبر. في اليوم الخامس ، سجل لوحة اليوم الثالث عن طريق عد اليرقات الحية والأجنة غير المفقسة ، وسجلها في دفتر ملاحظات في المختبر.
بعد وضع العلامات على الجزء الخلفي من اللوحة ، قم بنقل دودة خنثى L4 فردية إلى اللوحة. تأكد من عدم نقل أي أجنة أو ديدان أخرى إلى اللوحة. انقل دودة ذكر L4 واحدة على اللوحة التي تحتوي على خنثى L أربعة.
اسمح للديدان بالتزاوج ووضع ذرية لمدة 24 ساعة عند 20 درجة مئوية. سجل الصفيحة لليرقات الحية مقابل الأجنة غير المفقسة في اليوم الثالث. في اليوم التالي ، قم بتسمية مجموعة من اللوحات الجديدة ونقل الخنثى والذكور إلى اللوحة الجديدة.
تأكد من أن الخنثى قد وصل إلى مرحلة البلوغ. اسمح للخنثى بوضع ذرية لمدة 24 ساعة عند 20 درجة مئوية. سجل الصفيحة لليرقات الحية مقابل الأجنة غير المفقسة في اليوم الرابع.
في اليوم الثالث ، قم بتسمية مجموعة من الأطباق الجديدة وانقل الخنثى والذكر إلى اللوحة الجديدة. اسمح للديدان بوضع ذرية لمدة 24 ساعة عند 20 درجة. سجل اللوحة للأجنة الحية مقابل الأجنة غير المفرغة في اليوم الخامس.
باستخدام عداد الخلايا التفاضلية ، عد اليرقات الحية والأجنة غير المفقسة من لوحة اليوم الواحد وسجلها في دفتر ملاحظات في المختبر. في اليوم الرابع ، عد النسل الحي والأجنة غير المفقسة من لوحة اليوم الثاني وسجلها في دفتر ملاحظات في المختبر. تحقق من لوحة يوم واحد للذكور.
إذا حدث التزاوج ، فإن النسبة الوراثية المتوقعة للخنثى إلى الذكور هي 50 إلى 50. إذا كان اليوم الواحد لا يحتوي على أي ذكور ، فلن يحدث التزاوج بين الذكر والخنثى. تجاهل زوج التزاوج هذا وسجل الملاحظة في دفتر ملاحظات المختبر.
في اليوم الخامس ، عد اليرقات الحية والأجنة غير المفقسة من لوحة اليوم الثالث وسجلها في دفتر ملاحظات في المختبر. أسفرت مقايسة الصلاحية الجنينية ل N2 عن نسبة صلاحية 98.9٪ بينما أظهر كل من he-5 (e1490) و spo-11 (ok79) انخفاضا في الصلاحية الجنينية بنسبة 74.9٪ و 0.8٪ على التوالي. تم تحديد متوسط حجم الحضنة N2 و him-5 (e1490) و spo-11 (ok79) ليكون 217 و 105 و 219 على التوالي.
يعد التعرف على المراحل المختلفة لتطوير C.elegans أمرا مهما للحصول على بيانات دقيقة وقابلة للتكرار. نوصي بالتعرف على تطور الدودة باستخدام الصور والمجهر التشريحي. يعد هذا الإجراء خطوة أولى رائعة لتحديد ما إذا كان الجين متورطا في عملية تنموية ويمكن أن تتبعه تحليلات خلوية لتحديد العملية التي تعطلت.
