هذه الطريقة لديها القدرة على تعزيز تمايز الخلايا الجذعية العصبية في المختبر والمساهمة في علاج الأمراض العصبية مثل مرض باركنسون. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيق البلازما الباردة في الغلاف الجوي في خطوة واحدة للتمايز الموجهة آمنة من الخلايا الجذعية العصبية لزرع الأنسجة. البلازما الباردة في الغلاف الجوي يمكن أن تعزز الخلايا الجذعية العصبية التمايز في غضون فترة قصيرة من العلاج.
ومع الحاجة إلى مزيد من الضرر للخلايا، وتوفير الخلايا المطلوبة لزرع. تبدأ بزرع حوالي خمسة أضعاف عشرة إلى الخلايا الجذعية العصبية المورين الخامس في قارورة مربعة 25 سنتيمترا. تحتوي على خمسة ملليلترات من DMEM كاملة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية و5 في المئة ثاني أكسيد الكربون.
عندما تصل الخلايا إلى 85 في المئة التقاء، وغسل الثقافة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. قبل العلاج، مع ملليلتر واحد من 25 في المئة التربسين لمدة دقيقة واحدة. عندما تكون الخلايا منفصلة، إيقاف التفاعل مع ملليلتر واحد من الثقافة المتوسطة.
والماصة عدة مرات لتوليد تعليق خلية واحدة. بعد العد، تمييع الخلايا إلى اثنين من عشرة إلى الخلايا الرابعة لكل ملليلتر التركيز. بذور ملليلتر واحد من الخلايا الجذعية على واحد بولي-D-lysine غطاء المغلفة زلة في بئر في تسعة آبار من لوحة ثقافة 12 خلية.
تحقق من كثافة الخلايا تحت المجهر. وإرجاع الخلايا إلى الحاضنة لمدة 12 ساعة. عندما تعلق الخلايا، وغسل الغطاء زلات مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل غسل، وعلاج الخلايا مع المتوسطة التمايز لمدة 48 ساعة.
للحصول على طائرة، أولاً توصيل سلك الإخراج من مصدر الطاقة بجهاز البلازما النفاثة. وعلى غيض من الجهد العالي التحقيق مع سلك الانتاج للكشف عن الجهد. ثم قم بتوصيل الطرف الآخر من التحقيق الجهد العالي إلى منظار لتسجيل المعلومات من الجهد الناتج.
تحقق من الدائرة بأكملها للتأكد من أن إمدادات الطاقة، وoscilloscope ومسبار الجهد العالي كلها على الارض. وتحقق من خط الغاز للتأكد من أن أنبوب الغاز متصل بجهاز البلازما النفاث. بعد ذلك، افتح صمامات غاز الهيليوم والأكسجين وحدد تدفق الغاز إلى لتر واحد إلى 01 لترًا لكل دقيقة من الهليوم إلى الأكسجين.
تحقق من الدائرة مرة أخرى واضغط على زر الإخراج لإنشاء طائرة البلازما. البلازما لعلاج الخلايا الجذعية العصبية، تعيين المسافة بين فوهة الحقنة وأول بئر من الخلايا إلى 15 ملليمتر. استبدال اطالة في الثقافات الخلايا الجذعية العصبية مع 800 ميكرولترات من التمايز المتوسط الطازجة.
ووضع لوحة تحت الطائرات البلازما. التأكد من أن فوهة الحقنة ثابتة فوق مركز كل بئر. إنشاء ثلاث آبار مع البلازما لمدة 60 ثانية لكل علاج، وثلاثة آبار مع واحد في المئة الهيليوم وغاز الأكسجين لمدة 60 ثانية لكل علاج.
ترك ثلاثة آبار دون علاج، كضوابط. ثم استبدال super مع ملليلتر واحد من متوسط التمايز الطازجة. وإرجاع الخلايا إلى الحاضنة لمدة ستة أيام.
تحقق من حالة التمايز للمجموعات المختلفة يوميًا ، تحت مجهر ضوء النقيض من المرحلة المقلوبة. بعد العلاج، والسماح للخلايا لتكامل تماما في وسط حالة لمدة ساعة واحدة تقريبا قبل استبدال سوبرنات مع وسيط تمايز جديدة. لتحليل الفلورا المناعية، قم بإصلاح الثقافات باستخدام 500 ميكرولترات من أربعة في المئة شبه شكلي لكل بئر لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تليها ثلاثة شطف لمدة خمس دقائق لطيف ، مع ملليلتر واحد من PBS لكل غسل. المقبل، permeabilize عينات ثابتة مع 2 في المئة تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تليها الشطف لطيف كما هو موضح.
بعد الغسيل الأخير، كتلة أي ربط غير محددة مع ملليلتر واحد من مصل الماعز 10 في المئة في برنامج تلفزيوني لكل عينة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وتسمية الخلايا في كل بئر مع 300 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية من الفائدة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. تليها ثلاثة يغسل في برنامج تلفزيوني كما هو موضح.
بعد الغسيل الأخير، قم بتسمية الخلايا بـ 300 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة. احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. ثم شطف الخلايا بلطف مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في بئر لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.
صورة الخلايا على المجهر المفلور مجهزة المرشحات المناسبة. تظهر الخلايا الجذعية العصبية المعالجة بالبلازما معدل تمايز متسارع، ونسبة تمايز أعلى مقارنة بالسيطرة غير المعالجة، والخلايا الجذعية المعالجة في تدفق الغاز. بعد العلاج البلازما، نستين يقلل.
بيتا توبولين الثالث يزيد بشكل كبير. و O4 يزيد قليلا، بالمقارنة مع السيطرة على الخلايا الجذعية المعالجة وتدفق الغاز. وعلاوة على ذلك، بعد 60 ثانية من العلاج البلازما، ويلاحظ تعبير قوي من الخلايا العصبية ناضجة، والخلايا العصبية cholinergic، وعلامات الخلايا العصبية الحركية.
مع عدد قليل جدا من الخلايا العصبية GABAergic وserotonergic, وعدم الكشف عن الخلايا العصبية الدوبامين. أثناء محاولة هذه الإجراءات ، من المهم أن نتذكر ، علاج الخلايا مع جرعة البلازما المناسبة ، لأن فترة علاج البلازما الطويلة والمكثفة ستحث الخلايا المبرمج أو النخر. تذكر أيضا قبل اختبار صلاحية الخلية قبل تطبيق المتلقين للمعلومات.
