Este método tiene el potencial de mejorar la diferenciación de las células madre neurales in vitro y contribuir al tratamiento de enfermedades neurológicas como la enfermedad de Parkinson. Las principales ventajas de esta técnica es que los plasmas atmosféricos fríos se pueden aplicar en un solo paso para la diferenciación dirigida segura de las células madre neurales para el trasplante de tejido. El plasma atmosférico frío puede mejorar la diferenciación de las células madre neurales en un corto período de tratamiento.
Y con la necesidad de más daño a las células, proporcionando las células deseadas para el trasplante. Comience por sembrar unas cinco veces diez hasta la quinta célula madre neural murina en un matraz cuadrado de 25 centímetros. Contiene cinco mililitros de DMEM completo durante dos o tres días a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono.
Cuando las células alcancen el 85 por ciento de confluencia, lave el cultivo con un mililitro de PBS. Antes del tratamiento, con un mililitro de 25 por ciento de trippsina durante un minuto. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con un mililitro de medio de cultivo.
Y pipeta varias veces para generar una sola célula de suspensión. Después de contar, diluir las células a dos veces diez a las cuartas células por mililitro de concentración. Semilla de un mililitro de células madre en un resbalón de cubierta recubierto de poli-D-lisina por pozo en nueve pozos de una placa de cultivo celular de 12.
Compruebe la densidad celular bajo un microscopio. Y devolver las células a la incubadora durante 12 horas. Cuando las células se hayan unido, lave los resbalones de la cubierta dos veces con un mililitro de PBS por lavado, y trate las células con un medio de diferenciación durante 48 horas.
Para la adquisición de chorro, conecte primero el cable de salida de la fuente de alimentación al dispositivo de chorro de plasma. Y la punta de la sonda de alto voltaje con el cable de salida para detectar el voltaje. A continuación, conecte el otro extremo de la sonda de alto voltaje al osciloscopio para registrar la información de la tensión de salida.
Compruebe todo el circuito para asegurarse de que la fuente de alimentación, el osciloscopio y la sonda de alto voltaje estén conectadas a tierra. Y revise la línea de gas para asegurarse de que el tubo de gas está conectado al dispositivo de chorro de plasma. A continuación, abra las válvulas de gas de helio y oxígeno y ajuste el flujo de gas a una relación de 01 litros a 01 litros por minuto de helio a oxígeno.
Compruebe el circuito de nuevo y pulse el botón de salida para crear un chorro de plasma. Para tratar plasma las células madre neurales, establezca la distancia entre la boquilla de la jeringa y el primer pozo de células en 15 milímetros. Sustituya los sobrenadantes en los cultivos de células madre neurales por 800 microlitros de medio de diferenciación fresco.
Y coloque la placa debajo de los chorros de plasma. Asegurarse de que la boquilla de la jeringa esté fijada sobre el centro de cada pozo. Cree tres pozos con plasma durante 60 segundos por tratamiento, y tres pozos con un uno por ciento de helio y gas de oxígeno durante 60 segundos por tratamiento.
Dejando tres pozos sin tratar, como controles. A continuación, sustituya los sobrenadantes por un mililitro de medio de diferenciación fresco. Y devolver las células a la incubadora durante seis días.
Compruebe el estado de diferenciación de los diferentes grupos diariamente, bajo un microscopio de luz de contraste de fase invertida. Después del tratamiento, deje que las células se equilibren completamente en el medio de la condición durante aproximadamente una hora antes de reemplazar el sobrenadante por un medio de diferenciación fresco. Para el análisis de inmunofluorescencia, fije los cultivos con 500 microlitros de paraformaldehído cuatro por ciento per pozo durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Seguido de tres suaves enjuagues de cinco minutos, con un mililitro de PBS por lavado. A continuación, permeabilizar las muestras fijas con 2 por ciento Tritón X-100 en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Seguido de suave enjuague como se demuestra.
Después del último lavado, bloquee cualquier unión no específica con un mililitro de 10 por ciento de suero de cabra en PBS por muestra durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, etiquete las células en cada pozo con 300 microlitros del anticuerpo primario de interés durante la noche a cuatro grados centígrados. Seguido de tres lavados en PBS como se demuestra.
Después del último lavado, etiquete las células con 300 microlitros de los anticuerpos secundarios apropiados. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente, protegida de la luz. Luego enjuague las células suavemente con un mililitro de PBS por pozo durante diez minutos a temperatura ambiente.
Imagen de las células en un microscopio de fluorescencia equipado con los filtros adecuados. Las células madre neurales tratadas con plasma presentan una tasa de diferenciación acelerada y una mayor relación de diferenciación en comparación con el control no tratado, y las células madre tratadas con flujo de gas. Después del tratamiento plasmático, Nestin disminuye.
Beta-Tubulin III aumenta significativamente. Y O4 aumenta ligeramente, en comparación con las células madre tratadas con control y el flujo de gas. Además, después de 60 segundos de tratamiento plasmático, se observa una expresión robusta de neurona madura, neurona colinérgica, y marcadores de neuronas motoras.
Con muy pocas neuronas GABAérgicas y serotonérgicas, y no se detectan neuronas dopaminérgicas. Al intentar estos procedimientos, es importante recordar, tratar las células con la dosis plasmática adecuada, porque un largo e intenso período de tratamiento plasmático inducirá apoptosis celular o necrosis. Recuerde también probar previamente la viabilidad de la célula antes de la aplicación posterior.
