この方法は、インビトロにおける神経幹細胞の分化を高め、パーキンソン病などの神経疾患の治療に寄与する可能性を有する。この技術の主な利点は、組織移植のための神経幹細胞の安全な指向分化のために、冷大気プラズマを1つのステップで適用することができるということです。冷たい大気の血漿は、短い治療期間内に神経幹細胞の分化を高めることができる。
そして、細胞に多くの損傷を必要とし、移植のために所望の細胞を提供する。25センチメートルの正方形のフラスコに5番目のマウス神経幹細胞に約50倍の播種を開始します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で2〜3日間の完全なDMEMの5ミリリットルを含有する。
細胞が85%の合流度に達したら、PBSの1ミリリットルで培養物を洗浄する。治療前に、1ミリリットルの25%トリプシンを1分間使用する。細胞が剥離したら、1ミリリットルの培養培地で反応を停止する。
ピペットを数回、単一の細胞懸濁液を生成する。計数後、1ミリリットル当たり4番目の細胞に2倍10倍に希釈します。12個の細胞培養プレートの9つのウェルで、1つのポリD-リジンコーティングカバースリップ当たり1ミリリットルの幹細胞をシードします。
顕微鏡で細胞密度を確認します。そして、12時間培養器に細胞を戻す。細胞が付着したら、1回のPBSを1ミリリットルで2回カバースリップを洗浄し、分化培地で細胞を48時間処理します。
ジェット集録の場合は、まず電源の出力線をプラズマジェット装置に接続します。出力線を用いて高電圧プローブの先端を検出し、電圧を検出する。次に、高電圧プローブのもう一方の端をオシロスコープに接続して、出力電圧からの情報を記録します。
回路全体をチェックして、電源、オシロスコープ、高電圧プローブがすべて接地されていることを確認します。ガスラインを確認して、ガス管がプラズマジェット装置に接続されていることを確認します。次に、ヘリウムバルブと酸素ガスバルブを開き、ガスの流れをヘリウムと酸素の1分あたりの比で1リットル~01リットルに設定します。
回路をもう一度確認し、出力ボタンを押してプラズマジェットを作成します。血漿が神経幹細胞を治療するには、注射器ノズルと細胞の最初のウェルとの間の距離を15ミリメートルに設定します。神経幹細胞培養物の上清を800マイクロリットルの新鮮な分化培地に置き換えます。
そして、プラズマジェットの下にプレートを置きます。シリンジノズルが各井戸の中心に固定されていることを確認します。1回の処理で60秒間プラズマを備えた3つの井戸と、1回のヘリウムと酸素ガスを1%のウェルで10秒間作成します。
コントロールとして、3つの井戸を未処理のままにします。その後、上清を1ミリリットルの新鮮な分化培地に置き換えます。そして、6日間培養器に細胞を戻します。
逆相コントラスト光顕微鏡下で、異なるグループの分化状態を毎日確認してください。処理後、上清を新鮮な分化培地に置き換える前に、約1時間、条件培地中で細胞を完全に平衡化させる。免疫蛍光分析のために、室温で20分間、ウェルあたり4%パラホルムアルデヒドの500マイクロリットルで培養物を固定します。
その後、3つの穏やかな5分間のすがみ、1回の洗浄につき1ミリリットルのPBSが続きます。次に、PBSで2%のトリトンX-100で固溶試料を室温で10分間透過させる。デモンストレーションのように穏やかなすすがりを続きます。
最後の洗浄後、室温で1時間、PBSで10%のヤギ血清を1ミリリットルで非特異的結合をブロックします。インキュベーションの終了時に、各ウェルの細胞に、摂氏4度で一晩対象となる一次抗体の300マイクロリットルを標識する。示されているようにPBSで3回の打ち上がった。
最後の洗浄後、適切な二次抗体の300マイクロリットルで細胞にラベルを付けます。光から保護された室温で2時間インキュベートする。その後、室温で10分間、1ウェルあたりPBSを1ミリリットルで穏やかに洗い上げます。
適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡上の細胞を画像化します。血漿処理された神経幹細胞は、加速分化速度、及び未処理制御と比較して高い分化比、及びガス流処理幹細胞を示す。プラズマ処理後、ネスチンは減少する。
ベータ-チューブリンIIIは大幅に増加します。O4は、制御処理およびガス流処理幹細胞に比べてわずかに増加する。また、60秒の血漿治療の後、成熟したニューロン、コリン作動性ニューロン、および運動ニューロンマーカーの強い発現が観察される。
GABAergic およびセロトニン作動性ニューロンは非常に少なく、ドーパミン作動性ニューロンは検出されません。これらの手順を試みている間, 長く、強烈な血漿治療期間は、細胞アポトーシスや壊死を誘発するので、適切な血漿投与量で細胞を治療することを覚えておくことが重要です.また、下流のアプリケーションの前にセルの生存率を事前にテストすることを忘れないでください。
