一步冷常压等离子体体外处理神经干细胞分化

这种方法有可能增强神经干细胞在体外分化，并有助于治疗神经疾病，如帕金森病。该技术的主要优点是，冷大气等离子体可以一步地用于组织移植神经干细胞的安全定向分化。冷大气血浆可以在短时间内增强神经干细胞分化。

并且需要更多的损伤细胞，提供所需的细胞移植。首先在25厘米方的烧瓶中播种约五倍十至第五个穆林神经干细胞。在37摄氏度和5%的二氧化碳下，含有5毫升完整的DMEM，为期两到三天。

当细胞达到85%的汇合时，用一毫升PBS洗涤培养。治疗前，用一毫升25%的尝试性药物一分钟。当细胞分离时，停止与一毫升培养培养媒介的反应。

并移液器多次产生单个细胞悬浮液。计数后，稀释细胞到每毫升浓度的二倍十至第四细胞。将一毫升干细胞播种到12个细胞培养板的9口井中，每口井的一颗多D-Lysine涂层盖滑。

在显微镜下检查细胞密度。将细胞返回孵化器12小时。当细胞连接后，每次洗涤用一毫升 PBS 洗涤盖滑两次，用分化介质处理细胞 48 小时。

对于喷射采集，首先将电源的输出线连接到等离子喷射装置。和高压探头的尖端用输出线来检测电压。然后将高压探头的另一端连接到示波器，以记录来自输出电压的信息。

检查整个电路，确保电源、示波器和高压探头全部接地。并检查气体管，确保气体管连接到等离子喷射装置。接下来，打开氦气和氧气阀，将气体流量设置为每升 1 升至 01 升的氦气与氧的比例。

再次检查电路并按下输出按钮以创建等离子喷射。要对神经干细胞进行血浆治疗，将注射器喷嘴与细胞第一井之间的距离设置为 15 毫米。用800微升的新鲜分化介质代替神经干细胞培养中的超级细胞。

将板放在等离子喷头下。确保注射器喷嘴固定在每个孔的中心。创建三口带等离子体的井，每次处理60秒，用1%的氦气和氧气创建三口井，每次处理60秒。

留下三口井未经处理，作为控制。然后用一毫升的新鲜分化介质代替超自然剂。将细胞返回到孵化器六天。

在倒置相对比度光学显微镜下，每天检查不同组的不同组分化状态。治疗后，让细胞在条件介质中完全平衡约一小时，然后用新鲜的分化介质替换上经剂。对于免疫荧光分析，在室温下用每井4%的500微升固定培养物20分钟。

接着是三次温和的五分钟冲洗，每次洗涤一毫升 PBS。接下来，在室温下用2%Triton X-100在PBS中渗透固定样品10分钟。接着是温柔的冲洗，如证明。

上次洗涤后，在室温下，将每份样品 PBS 中 PBS 中 1 毫升的 10% 山羊血清中的任何非特异性结合块块，持续一小时。在孵育结束时，在每一个井的细胞上贴上300微升的原抗体，在4摄氏度下过夜。接着是 PBS 中的三次洗涤，如演示。

最后一次洗涤后，用300微升的合适二级抗体给细胞贴上标签。在室温下孵育两小时，防止光线。然后在室温下用每口一毫升PBS轻轻冲洗细胞10分钟。

在配备适当过滤器的荧光显微镜上对细胞进行成像。与未经治疗的对照和气体流处理干细胞相比，血浆处理的神经干细胞表现出加速分化率和较高的分化率。血浆治疗后，内辛减少。

Beta-Tubulin III 显著增加。与控制处理和气体流量处理干细胞相比，O4略有增加。此外，在血浆治疗60秒后，观察到成熟神经元、胆碱神经元和运动神经元标记的强健表达。

与很少的GABAergic和血清素神经元，没有检测到多巴胺神经元。在尝试这些程序时，重要的是要记住，用适当的血浆剂量治疗细胞，因为一个漫长而激烈的血浆治疗期会诱发细胞凋亡或坏死。请记住，在下游应用之前，还要预先测试细胞的生存能力。