이 방법은 체외에서 신경 줄기 세포의 분화를 강화하고 파킨슨 병과 같은 신경 질환의 치료에 기여할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 차가운 대기 플라즈마가 조직 이식을 위한 신경 줄기 세포의 안전한 지시분화를 위해 한 단계로 적용될 수 있다는 것입니다. 차가운 대기 플라즈마는 짧은 처리 기간 내에 신경 줄기 세포 분화를 향상시킬 수 있습니다.
그리고 이식을 위해 원하는 세포를 제공하는 세포에 더 많은 손상이 필요합니다. 25센티미터 정사각형 플라스크에서 다섯 번째 뮤린 신경 줄기 세포에 약 5회 10번 을 시드하여 시작합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2~3일 동안 5밀리리터의 완전한 DMEM을 함유하고 있습니다.
세포가 85%의 합류에 도달하면 PBS의 1밀리리터로 배양을 씻으시다. 치료 하기 전에, 1 밀리 리터와 함께 25 1 분 동안 % 트립신. 세포가 분리되면 배양 배지의 1 밀리리터로 반응을 중지하십시오.
그리고 파이펫은 단일 셀 서스펜션을 생성하기 위해 여러 번. 계산 후, 밀리리터 농도 당 네 번째 세포에 2 회 10으로 세포를 희석. 줄기 세포의 1 밀리리터를 12 세포 배양 판의 9개의 우물에서 잘 당 폴리 D-lysine 코팅 커버 슬립에 시드.
현미경의 밑에 세포 조밀도를 확인하십시오. 그리고 세포를 인큐베이터로 12 시간 동안 반환합니다. 세포가 부착되면, 커버는 세척 당 PBS의 1 밀리리터로 두 번 미끄러짐을 세척하고 48 시간 동안 분화 매체로 세포를 치료하십시오.
제트 획득을 위해 먼저 전원 공급 장치의 출력 와이어를 플라즈마 제트 장치에 연결합니다. 그리고 전압을 검출하는 출력 와이어와 고전압 프로브의 끝. 그런 다음 고전압 프로브의 다른 끝을 오실로스코프에 연결하여 출력 전압에서 정보를 기록합니다.
전원 공급 장치, 오실로스코프 및 고전압 프로브가 모두 접지되었는지 확인하기 위해 전체 회로를 확인하십시오. 그리고 가스 라인을 확인하여 가스 튜브가 플라즈마 제트 장치에 연결되어 있는지 확인하십시오. 다음으로 헬륨 및 산소 가스 밸브를 열고 가스 흐름을 분당 01리터에서 산소에 대한 밀리엄 비율로 설정합니다.
회로를 다시 확인하고 출력 버튼을 눌러 플라즈마 제트를 만듭니다. 신경 줄기 세포를 플라즈마 처리하려면 주사기 노즐과 세포의 첫 번째 우물 사이의 거리를 15 mm로 설정합니다. 신경 줄기 세포 배양에 있는 supernatants를 신선한 분화 매체의 800 마이크로리터로 대체하십시오.
그리고 플라즈마 제트 아래에 접시를 배치합니다. 주사기 노즐이 각 우물의 중앙에 고정되어 있는지 확인합니다. 처리당 60초 동안 플라즈마로 3개의 우물을 만들고, 치료당 60초 동안 헬륨과 산소 가스가 1%인 3개의 우물을 만듭니다.
세 개의 우물을 컨트롤로 처리하지 않고 둡시합니다. 그런 다음 슈퍼네티를 신선한 분화 매체의 1 밀리리터로 대체하십시오. 그리고 6 일 동안 인큐베이터에 세포를 반환합니다.
반전 된 위상 대비 빛 현미경에서 매일 다른 그룹의 분화 상태를 확인합니다. 치료 후, 세포가 상체를 신선한 분화 배지로 대체하기 전에 약 1 시간 동안 조건 배지에서 완전히 평형화되도록 합니다. 면역 불경증 분석을 위해 실온에서 20 분 동안 잘 4 % 파라 포름 알데히드의 500 마이크로 리터로 배양을 수정합니다.
그 다음에는 3개의 부드러운 5분간 헹구고, 세척당 PBS 1밀리리터가 있습니다. 다음으로, PBS에서 2%의 Triton X-100을 실온에서 10분 동안 고정 시료를 투과합니다. 그 다음에는 부드럽게 헹군다.
마지막 세척 후, 실온에서 1 시간 동안 샘플 당 PBS에서 1밀리리터의 1밀리리터로 비특이적 결합을 차단합니다. 인큐베이션의 끝에서, 4섭씨에서 하룻밤 관심의 1 차 적인 항체의 300 마이크로 리터로 각 우물에 있는 세포를 레이블. 그 다음에는 PBS에서 세 번의 세 번의 세가지 세차정이 시연되었습니다.
마지막 세척 후, 적절한 이차 항체의 300 마이크로리터로 세포를 라벨. 빛으로부터 보호, 실온에서 2 시간 동안 배양. 그런 다음 실온에서 10 분 동안 잘 당 PBS의 1 밀리리터로 부드럽게 세포를 헹구십시오.
적절한 필터가 장착된 형광 현미경의 세포를 이미지합니다. 플라즈마 처리 된 신경 줄기 세포는 가속 분화 속도를 나타내며, 처리되지 않은 대조군및 가스 흐름 처리 줄기 세포에 비해 더 높은 분화 비. 플라즈마 처리 후 네신은 감소합니다.
베타-투불린 III 크게 증가. 및 O4는 처리된 대조군 및 가스 흐름 처리 줄기 세포에 비해 약간 증가한다. 또한, 60초의 혈장 치료 후 성숙한 뉴런, 콜린성 뉴런 및 운동 신경 마커의 견고한 발현이 관찰된다.
아주 몇몇 GABAergic 및 세로토너기신경, 그리고 아무 도파민지 뉴런 검출. 이러한 절차를 시도하는 동안, 기억 하는 것이 중요 하다, 적절 한 플라즈마 복용량으로 세포를 치료, 길고 강렬한 플라즈마 치료 기간 세포 세포 세포 세포 또는 괴 사를 유도 하기 때문에. 다운스트림 응용 프로그램 전에 셀 생존 가능성을 미리 테스트해야 합니다.
