Diese Methode hat das Potenzial, die Differenzierung von neuronalen Stammzellen in vitro zu verbessern und zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen wie Parkinson beizutragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die kalten atmosphärischen Plasmae in einem Schritt zur sicheren gerichteten Differenzierung neuronaler Stammzellen für die Gewebetransplantation eingesetzt werden können. Kaltes atmosphärisches Plasma kann die Differenzierung neuronaler Stammzellen innerhalb kurzer Behandlungszeit verbessern.
Und mit der Notwendigkeit mehr Schäden an den Zellen, die die gewünschten Zellen für die Transplantation zur Verfügung stellen. Beginnen Sie mit der Aussaat etwa fünf mal zehn bis fünf murine neuronalen Stammzellen in einem 25 Zentimeter großen quadratischen Kolben. Enthält fünf Milliliter komplettedmEM für zwei bis drei Tage bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid.
Wenn die Zellen 85 Prozent Koninfluenza erreichen, waschen Sie die Kultur mit einem Milliliter PBS. Vor der Behandlung, mit einem Milliliter von 25 Prozent Trypsin für eine Minute. Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit einem Milliliter Kulturmedium.
Und Pipette mehrmals, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Nach dem Zählen verdünnen Sie die Zellen auf zwei mal zehn bis vier Zellen pro Milliliter Konzentration. Samen Eines Milliliter Stoles von Stammzellen auf einem poly-D-Lysin beschichteten Decksrutsch pro Brunnen in neun Brunnen einer 12-Zell-Kulturplatte.
Überprüfen Sie die Zelldichte unter dem Mikroskop. Und geben Sie die Zellen für 12 Stunden in den Inkubator zurück. Wenn die Zellen befestigt sind, waschen Sie die Abdeckung saust zweimal mit einem Milliliter PBS pro Wäsche, und behandeln Sie die Zellen mit Differenzierungsmedium für 48 Stunden.
Schließen Sie für die Strahlaufnahme zunächst den Ausgangsdraht des Netzteils an das Plasmastrahlgerät an. Und die Spitze der Hochspannungssonde mit dem Ausgangsdraht, um die Spannung zu erkennen. Schließen Sie dann das andere Ende der Hochspannungssonde an das Oszilloskop an, um die Informationen von der Ausgangsspannung aufzuzeichnen.
Überprüfen Sie die gesamte Schaltung, um sicherzustellen, dass das Netzteil, das Oszilloskop und die Hochspannungssonde alle geerdet sind. Überprüfen Sie die Gasleitung, um sicherzustellen, dass die Gasröhre mit dem Plasmastrahlgerät verbunden ist. Öffnen Sie anschließend die Helium- und Sauerstoffgasventile und stellen Sie den Gasstrom auf einen Liter auf 01 Liter pro Minute, das Verhältnis von Helium zu Sauerstoff.
Überprüfen Sie die Schaltung erneut und drücken Sie die Ausgangstaste, um einen Plasmastrahl zu erstellen. Um die neuronalen Stammzellen zu behandeln, legen Sie den Abstand zwischen der Spritzendüse und dem ersten Bohrkörper der Zellen auf 15 Millimeter fest. Ersetzen Sie die Überstande in den neuronalen Stammzellkulturen durch 800 Mikroliter frisches Differenzierungsmedium.
Und legen Sie die Platte unter die Plasmadüsen. Stellen Sie sicher, dass die Spritzendüse über der Mitte jedes Brunnens befestigt ist. Erstellen Sie drei Brunnen mit Plasma für 60 Sekunden pro Behandlung und drei Brunnen mit einem Prozent Helium und Sauerstoffgas für 60 Sekunden pro Behandlung.
Lassen Sie drei Brunnen unbehandelt, als Kontrollen. Dann ersetzen Sie die Überräube durch einen Milliliter frisches Differenzierungsmedium. Und geben Sie die Zellen für sechs Tage in den Inkubator zurück.
Überprüfen Sie den Differenzierungsstatus der verschiedenen Gruppen täglich unter einem invertierten Phasenkontrastlichtmikroskop. Nach der Behandlung lassen Sie die Zellen im Zustandsmedium für etwa eine Stunde vollständig ausausgleichen, bevor sie den Überstand durch ein frisches Differenzierungsmedium ersetzen. Für die Immunfluoreszenzanalyse fixieren Sie die Kulturen mit 500 Mikrolitern von vier Prozent Paraformaldehyd pro Brunnen für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
Gefolgt von drei sanften fünfminütigen Spülungen mit einem Milliliter PBS pro Wäsche. Als nächstes permeabilisieren Sie die festen Proben mit 2 Prozent Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Gefolgt von sanftem Spülen, wie gezeigt.
Nach der letzten Wäsche jede unspezifische Bindung mit einem Milliliter 10 Prozent Ziegenserum in PBS pro Probe für eine Stunde bei Raumtemperatur blockieren. Am Ende der Inkubation die Zellen in jedem Brunnen mit 300 Mikrolitern des primären Interessierenden über Nacht bei vier Grad Celsius beschriften. Gefolgt von drei Wähungen in PBS, wie gezeigt.
Nach der letzten Wäsche die Zellen mit 300 Mikrolitern der entsprechenden Sekundärantikörper beschriften. Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, vor Licht geschützt. Dann spülen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Milliliter PBS pro Brunnen für zehn Minuten bei Raumtemperatur.
Bildnis die Zellen auf einem Fluoreszenzmikroskop, das mit den entsprechenden Filtern ausgestattet ist. Plasmabehandelte neuronale Stammzellen weisen eine beschleunigte Differenzierungsrate und ein höheres Differenzierungsverhältnis im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle auf und gasströmungsbehandelte Stammzellen. Nach der Plasmabehandlung nimmt Nestin ab.
Beta-Tubulin III erhöht sich signifikant. Und O4 steigt leicht an, im Vergleich zu kontrollbehandelten und gasstrombehandelten Stammzellen. Darüber hinaus wird nach 60 Sekunden Der Plasmabehandlung eine robuste Expression von reifen Neuronen, cholinergen Neuronen und motorischen Neuronmarkern beobachtet.
Mit sehr wenigen GABAergic und serotonerge Neuronen, und keine dopaminergen Neuronen nachgewiesen. Beim Versuch dieser Verfahren, Es ist wichtig, sich zu erinnern, behandeln Sie die Zellen mit der richtigen Plasma-Dosierung, weil eine lange und intensive Plasma-Behandlungsphase Wird Zellapoptose oder Nekrose induzieren. Denken Sie daran, auch die Zelllebensfähigkeit vor der nachgelagerten Anwendung zu testen.
