هذا البروتوكول مكننا من حل هيكل TRPC3 الإنسان، وهو عضو في عائلة هامة، ولكن غير مدروسة من القنوات الأيونية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الكفاءة العالية التي يمكن تطبيقها للتعبير عن مجموعة متنوعة من البروتينات وتنقيتها، لكل من الدراسات الهيكلية والوظيفية. يمكن أن توفر هذه الطريقة تعبيرًا عن البروتين ونظام تنقية فعال، لاستخدامه في دراسة الكيمياء الحيوية والبروتينات والفيزياء الحيوية، ويمكن تطبيقه على مجموعة واسعة من القنوات الأيونية وغيرها من البروتينات الأغشية.
أولاً، تحقق من تعبير الفيروس النسبي عن طريق عرض الفلوريسة GFP للفيروس في عينة من الفيروسات المنتجة. في قارورة ثقافة Erlenmeyer في قاع حيرة ذات حجم كاف ، قم بإعداد حجم مرغوب فيه لثقافة تعليق الخلايا الثديية HEK293 ، بتركيز 3.5 إلى 3.8 مليون خلية لكل ملليلتر في وسيط التعبير ، مع استكمالها بـ FBS معقمة 1٪. إضافة 8٪ من حجم مجهز P2 حل مخزون الفيروس واحتضان في شاكر المدارية في 37 درجة مئوية و 135 دورة في الدقيقة.
في 12 إلى 18 ساعة بعد العدوى إضافة 10 ملليمولار بوترات الصوديوم، واحتضان في 30 درجة مئوية لمقدار الوقت اللازم للتعبير الأمثل عن البروتين. بعد هذا، الطرد المركزي في 2، 880 مرة الجاذبية لمدة 20 دقيقة لحصاد الخلايا. غسل وإعادة تعليق الخلايا في ما يقرب من 100 ملليلتر من TBS لكل لتر من الخلايا التي تم حصادها.
أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 2، 880 مرة الجاذبية لمدة 20 دقيقة وجمع بيليه الخلية. أيضا جمع صغيرة, وحصاد بيليه خلية ملليلتر واحد في نقاط زمنية متفاوتة و solubilize لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية مع التحريض في وجود المنظفات المختلفة و / أو إضافات. توضيح هذه صغيرة كاملة الخلية solubilized عينات عن طريق الrifugation للغاية في 235، 000 مرة الجاذبية وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
ثم، تشغيلها كما عينات ميكرولتر 30 على عمود كروماتوغرافيا SEC، لتحديد أفضل وقت للتعبير وأفضل ظروف solubilization. ذوبان بيليه في 100 ملليلتر من العازلة لكل لتر من الخلايا التي تم حصادها. مرة واحدة يتم إذابة الخلايا، ماصة أو تحريكها لضمان الحل هو متجانس.
السماح للخلايا solubilize في أربع درجات مئوية في منقار مغمورة في الجليد لمدة ساعتين في حين يجري اثارة من قبل شريط ضجة. بعد ذلك، إزالة أي حطام الخلية عن طريق الإبعاد فائقة التركيز في 235، 000 مرة الجاذبية وعند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. تشغيل عينة 30 ميكرولتر من عظمى على عمود SCC بواسطة HPLC للتحقق من كمية البروتين وتصور البروتين المستهدف من قبل إخراج إشارة GFB.
تطبيق الكوبالت تقارب الراتنج ملزمة supernatant تحتوي على البروتين solubilized إلى عمود الجاذبية وجمع تدفق من خلال. تشغيل عينة 30 ميكرولتر من تدفق من خلال على عمود SCC للتحقق من البروتين هو ملزم للراتنج. ثم، وغسل الراتنج مع 10 مجلدات عمود من المخزن المؤقت.
تشغيل عينة 30 ميكرولتر من غسل على عمود SCC للتحقق من فقدان البروتين. باستخدام العازلة، elute الراتنج ملزمة TRPC3 الإنسان. تشغيل عينة 90 ميكرولتر من المائل الذي تم تخفيفه واحد إلى 100 على عمود SSC للتحقق من أن البروتين قد تم استلفيرها والتحقق من وجود إشارة GFP في الموقف المقابل لحجم البروتين المستهدف.
إضافة ثرومبين في نسبة 1 إلى 20 الضرس وإضافة 10 ملليمولار من EDTA إلى عينة مائل. احتضان أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك، نقل eluant إلى أنبوب تصفية الطرد المركزي 15 ملليلتر.
تدور الأنبوب في 2، 800 مرة الجاذبية وعلى أربع درجات مئوية في خمس زيادات دقيقة لتركيز eluant إلى 500 ميكرولترات أو أقل. ماينيت محلول البروتين صعودا وهبوطا بين يدور لإعادة تعليق البروتين ومنع أكثر من التركيز. تحميل التركيز إلى عمود SSC في المخزن المؤقت.
تشغيل الكروماتوغرافيا السائلة البروتين السريع وجمع 300 كسور ميكرولتر. ثم، والجمع بين الكسور الذروة التي تحتوي على TRPC3 tetramer كما تصورها إشارة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. ونركز مرة أخرى على تركيز نهائي لا يقل عن خمسة ملليغرام لكل ملليلتر.
TRPC3 الإنسان هو الخلية كاملة solubilized في مجموعة متنوعة من المنظفات مع تركيز micelle الحرجة من 0.01 إلى 20 ميكروموللار، وكان يعمل في DDM / CHS التي تحتوي على العازلة. على الرغم من أن DDM /CHS يظهر أعلى قابلية للذوبان من TRPC3 الإنسان، موقف الذروة يبدو أكبر من أن يكون TRPC الإنسان رباعية 3. بعد سولوبيلي الخلايا كاملة يتم إزالة الحطام تحلل الخلية ويتم تحميل البروتين سولوبيلد على عمود SSC وتشغيلها على HPLC في DDM / CHS المنظفات التي تحتوي على العازلة، لمقارنة الذوبان المطلق وحجم الذروة من TRPC3 الإنسان تحت ظروف مختلفة بالنسبة لعنصر التحكم TRPM4.
جميع عينات المنظفات المختلفة solubilized TRPC3 تظهر مواقف الذروة حول 11.9 ملليلتر والتي من المرجح أن تكون كبيرة جدا لأن شكل رباعية اسخونية من TRPC3 الإنسان لديه وزن جزيئي أصغر من التحكم البشري الإيجابي TRPM4. يتم اختبار اثنين من solubilization مختلفة وتشغيل المخازن المؤقتة التي تحتوي على DDM/CHS و digitonin. البروتين الذي يتم تشغيله في المخزن المؤقت الذي يحتوي على digitonin ينتج أعلى قمة في موقف معقول بالنسبة للسيطرة الإيجابية.
في حين أن تنقية صغيرة النطاق باستخدام 25 ملليلتر من الخلايا يظهر العديد من القمم العريضة، يظهر البروتين ملامح قناة TRPC3 الإنسان رباعية واحدة في تصنيف 2D عن طريق وصمة عار سلبية. ثم يتم فحص المواد المضافة بناء على الطابع الفسيولوجي لـ TRPC3 الإنسان. EDTA يظهر تأثير ملحوظ على استقرار TRPC3 الإنسان في موقف الذروة رباعية اكريتي سليمة وزيادة كبيرة في عدد الجسيمات في micrograph cryo-EM وانخفاض الضوضاء في الخلفية.
تعتمد جودة النتائج النهائية على استكشاف أخطاء جيدة من ملفات تعريف FSCC على HPLC. وعلى الانتهاء من جميع خطوات تنقية بسرعة، من الناحية المثالية في يوم واحد. يمكن إجراء التحديد الهيكلي ، وتوليد الأجسام المضادة ، والدراسات الوظيفية مثل ، المقايسات الملزمة أو الفيزيولوجيا الكهربائية بعد هذا الإجراء.
هذه التقنية يمكن وقد تم تكييفها لدراسة القنوات الأخرى أيون وعائلات البروتين وإنتاج البروتينات النقية لتطبيقات تتجاوز تحديد الهيكلية. وينبغي اتخاذ الاحتياطات المناسبة لإدارة الخلايا الحيوية مثل العمل في غطاء تدفق لارينار، وارتداء الملابس الواقية، والتخلص من النفايات بشكل صحيح.
