Bu protokol bize insan TRPC3, iyon kanallarının önemli, ama az çalışılmış bir ailenin üyesi yapısını çözmek için sağladı. Bu tekniğin en büyük avantajı, hem yapısal hem de fonksiyonel çalışmalar için çeşitli proteinleri ifade etmek ve arındırmak için uygulanabilen yüksek verimliliktir. Bu yöntem, protein biyokimyası ve biyofiziğinin incelenmesinde kullanılmak üzere etkin bir protein ekspresyonu ve saflaştırma sistemi sağlayabilir ve çok çeşitli iyon kanallarına ve diğer membran proteinlerine uygulanabilir.
İlk olarak, virüs üreten kültür bir örnekte virüsün GFP floresan sını görüntüleyerek göreli virüs ifadesini kontrol edin. Yeterli büyüklükte bir şaşkın alt Erlenmeyer kültür şişesinde, bir HEK293 memeli hücre süspansiyon kültürünün arzu edilen bir hacim hazırlamak, ifade orta mililitre başına 3,5 ila 3,8 milyon hücre konsantrasyonu, 1% steril FBS ile takviye. Hazırlanan P2 virüs stok çözeltisi hacmine göre% 8 ekleyin ve 37 derece santigrat ve 135 RPM bir Orbital Shaker inkübat.
12 ila 18 saat post-enfeksiyon 10 milimolar sodyum bütırat ekleyin, optimal protein ekspresyonu için gerekli süre için 30 santigrat derece kuluçka. Bundan sonra, 2, 880 kez yerçekimi 20 dakika hücre hasat için santrifüj. Yıkama ve hasat hücrelerin litre başına TBS yaklaşık 100 mililitre hücreleri yeniden askıya.
20 dakika boyunca 2, 880 kez yerçekimi tekrar santrifüj ve hücre pelet toplamak. Ayrıca farklı zaman noktalarında küçük, bir mililitre hücreli pelet hasat toplamak ve farklı deterjanlar ve / veya katkı maddeleri varlığında ajitasyon ile dört derece santigrat iki saat boyunca solubilize. 235, 000 kez yerçekimi ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat bu küçük bütün hücre çözünürörnekleri açıklığa kavuşturmak.
Daha sonra, ifade için en iyi zamanı ve en iyi islübilizasyon koşullarını belirlemek için sec kromatografi sütununda 30 mikrolitre lik örnek olarak çalıştırın. Hasat edilen hücrelerin litre başına tampon 100 mililitre pelet çözülür. Hücreler çözüldükten sonra, pipet veya çözeltihomojen olduğundan emin olmak için onları karıştırın.
Hücreler bir karıştırma çubuğu tarafından karıştırılırken iki saat boyunca buza batırılmış bir kabın içinde dört derecede çözünsün. Sonra, 235, 000 kez yerçekimi ve bir saat için dört derece santigrat herhangi bir hücre enkaz kaldırın. Protein miktarını doğrulamak ve Hedef proteini GFB sinyal çıkışı ile görselleştirmek için HPLC tarafından bir SCC sütununda süpernatantın 30 mikrolitrelik bir örneğini çalıştırın.
Bir yerçekimi sütununa çözünür protein içeren kobalt afinite reçine bağlı supernatant uygulayın ve akış-through toplamak. Proteinin reçineye bağlı olduğunu doğrulamak için bir SCC sütunundaki 30 mikrolitrelik bir akış örneğini çalıştırın. Ardından, reçineyi 10 sütun hacmi arabellekle yıkayın.
Protein kaybıolup değil kontrol etmek için bir SCC sütunüzerinde yıkama 30 mikrolitre lik bir örnek çalıştırın. Tampon kullanarak, reşin bağlı insan TRPC3 elute. Proteinin eluted olup olmadığını kontrol etmek ve hedef protein boyutuna karşılık gelen pozisyonda bir GFP sinyali varlığını doğrulamak için bir SSC sütununda 1 ila 100 seyreltilmiş olan eluant 90 mikrolitrelik bir örnek çalıştırın.
Trombin'i 1-20 azı dişi oranında ekleyin ve eluted örneğine 10 milimolar EDTA ekleyin. Üç saat boyunca dört derecede kuluçkaya yat. Bundan sonra, 15 mililitrelik santrifüj filtre tüpü ne aktarım.
Tüpü 2, 800 kat yerçekiminde ve dört santigrat derecede beş dakikalık artışlarla döndürün ve eluant'ı 500 mikrolitre veya daha azına yoğunlaştırın. Pipet protein çözeltisi yukarı ve aşağı spin arasında protein resuspend ve konsantre üzerinde önlemek için. Konsantreyi arabellekteki bir SSC sütununa yükleyin.
Hızlı protein sıvı kromatografi çalıştırın ve 300 mikrolitre fraksiyonları toplamak. Daha sonra, TRPC3 tetramer içeren tepe fraksiyonları uv emici sinyal tarafından görselleştirilmiş olarak birleştirin. Ve mililitre başına en az beş miligramlık son konsantrasyona tekrar konsantre ol.
İnsan TRPC3 0.01-20 mikromolar kritik micelle konsantrasyonu ile deterjanlar çeşitli çözünürlü bütün hücre, ve tampon içeren bir DDM / CHS çalıştırıldı. DDM/CHS insan TRPC3'ün en yüksek çözünürlüğünü gösterse de, tepe konumu tetramerik insan TRPC3 olamayacak kadar büyük görünür. Tüm hücreler çözündükten sonra hücre lisis enkazı çıkarılır ve çözünür protein bir SSC sütununa yüklenir ve trpm4 kontrolüne göre farklı koşullar altında insan TRPC3'ün mutlak çözünürlüğü ve en yüksek hacmini karşılaştırmak için tampon içeren DDM/CHS deterjanı bulunan HPLC üzerinde çalıştırılır.
Tüm farklı deterjan çözünmüş TRPC3 örnekleri, insan TRPC3 tetramerik formu pozitif insan kontrolü TRPM4 daha küçük bir moleküler ağırlığa sahip olduğu için büyük olasılıkla çok büyük 11,9 mililitre civarında pik pozisyonları göstermektedir. DDM/CHS ve digitonin içeren iki farklı çözünme ve çalışan arabellek test edilir. Digitonin içeren tamponda çalışan protein, pozitif kontrole göre makul bir pozisyonda en yüksek tepeyi verir.
Hücrelerin 25 mililitre kullanarak küçük bir ölçekli arınma birkaç geniş zirveleri gösterirken, protein negatif leke ile 2D sınıflandırmasında tek bir tetramerik insan TRPC3 kanalının özelliklerini gösterir. Katkı maddeleri daha sonra insan TRPC3 fizyolojik karakteri ne göre taranır. EDTA bozulmamış tetramerik pik pozisyonda insan TRPC3 stabilize üzerinde dikkate değer bir etki gösterir ve önemli ölçüde kriyo-EM mikrograf parçacıklarının sayısını artırdı ve arka planda gürültü azaldı.
Nihai sonuçların kalitesi, HPLC'deki FSCC profillerinin iyi bir şekilde giderilen sorun giderme durumuna bağlıdır. Ve tüm arınma adımlarını hızlı bir şekilde tamamlarken, ideal olarak tek bir günde. Yapısal tayin, antikor üretimi ve fonksiyonel çalışmalar gibi, bağlayıcı tahliller veya elektrofizyoloji bu işlemden sonra yapılabilir.
Bu teknik, diğer iyon kanalları ve protein ailelerini incelemek ve yapısal tayinin ötesindeki uygulamalar için saflaştırılmış proteinler üretmek için uyarlanabilir ve uyarlanmıştır. Laminar akış başlığında çalışmak, koruyucu giysiler giymek ve atıkların düzgün bir şekilde atılması gibi hücre kültürü biyolojik tehlikelerinin yönetimi için uygun önlemler alınmalıdır.
