Этот протокол позволил нам решить структуру человека TRPC3, члена важного, но недостаточно изученного семейство ионных каналов. Основным преимуществом этого метода является высокая эффективность, с которой он может быть применен для выражения и очистки различных белков, как для структурных, так и для функциональных исследований. Этот метод может обеспечить эффективную систему экспрессии и очистки белка, для использования в изучении биохимии белка и биофизики и может быть применен к широкому спектру ионных каналов и других мембранных белков.
Во-первых, проверьте относительное выражение вируса, просмотрев флуоресценцию вируса GFP в образце культуры производства вируса. В сбитой с толку нижней колбе культуры Эрленмейера достаточного размера подготовьтесь к желательному объему культуры подвески клеток млекопитающих HEK293, при концентрации от 3,5 до 3,8 миллиона клеток на миллилитр в экспрессионной среде, дополненной 1%стерильным FBS. Добавьте 8% по объему подготовленного раствора вируса P2 и инкубировать в Orbital Shaker при 37 градусах Цельсия и 135 об/мин.
При 12-18 часах после заражения добавляем 10 миллимолярдных бутиратов натрия, инкубируют при 30 градусах Цельсия на время, необходимое для оптимального экспрессии белка. После этого центрифуга при 2, 880 раз гравитации в течение 20 минут, чтобы собрать клетки. Вымойте и повторно помесить клетки примерно в 100 миллилитров TBS на литр собранных клеток.
Центрифуга снова на 2, 880 раз тяжести в течение 20 минут и собирать гранулы клетки. Также собирать небольшие, один миллилитр клеток гранулы урожаи в различных точках времени и solubilize в течение двух часов при четырех градусах по Цельсию с возбуждением в присутствии различных моющих средств и / или добавок. Уточните эти небольшие целые клетки solubilized образцов путем ультрацентрифугации в 235000 раз тяжести и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Затем запустите их в виде 30 образцов микролитров в столбце хроматографии SEC, чтобы определить наилучшее время для выражения и лучшие условия solubilization. Оттепель гранулы в 100 миллилитров буфера на литр собранных клеток. После того, как клетки оттаяли, пипетки или перемешать их, чтобы обеспечить раствор однородным.
Пусть клетки solubilize при четырех градусах по Цельсию в стакан погружается во льду в течение двух часов в то время как перемешивают перемешать бар. Затем удалите все обломки клеток с помощью ультрацентрифугации при 235 000 раз больше гравитации и при четырех градусах Цельсия в течение одного часа. Выполните 30 микролитровый образец супернатанта на колонке SCC от HPLC, чтобы проверить количество белка и визуализировать целевой белок по выходу сигнала GFB.
Применить кобальта сродства смолы связаны супернатант, содержащий solubilized белка на гравитационный столбец и собирать поток через. Выполните 30 микролитровый образец протекаемого на столбце SCC, чтобы проверить, что белок привязен к смоле. Затем вымойте смолу 10 объемами буфера.
Вы запустите 30 микролитров образца стирки на колонке SCC, чтобы проверить потерю белка. Используя буфер, elute смолы связаны человека TRPC3. Вы запустите 90 микролитер образца элуанта, который был разбавлен от одного до 100 на колонке SSC, чтобы проверить, что белок был eluted и проверить наличие сигнала GFP в положении, соответствующем целевому размеру белка.
Добавьте тромбин в соотношении от одного до 20 моляров и добавьте 10 миллимоларов ЭДТА в элевированную выборку. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение трех часов. После этого перенесите элуант в 15-миллилитровую центробежную фильтровальную трубку.
Спин трубки в 2800 раз тяжести и при четырех градусах по Цельсию в пять минут шагом, чтобы сконцентрировать элуант до 500 микролитров или меньше. Pipette раствор белка вверх и вниз между спинами, чтобы повторно использовать белок и предотвратить чрезмерное концентрацию. Загрузите концентрат на столбец SSC в буфере.
Вы запустите быструю белковую жидкую хроматографию и соберите 300 фракций микролитров. Затем объедините пиковые фракции, содержащие тетрамер TRPC3, как визуализировано ультрафиолетовым сигналом поглощения. И снова сосредоточьтесь на конечной концентрации не менее пяти миллиграммов на миллилитр.
Человеческий TRPC3 является цельной клеткой solubilized в различных моющих средств с критической концентрацией micelle от 0,01 до 20 микромоляров, и был запущен в DDM / CHS, содержащий буфер. Хотя DDM/CHS показывает самую высокую слуготовость человека TRPC3, пиковое положение кажется слишком большим, чтобы быть тетрамерным человеком TRPC3. После солюбимости целых клеток удаляется клеточныйлизный мусор, а растворимый белок загружается на колонку SSC и работает на HPLC в моющих средствах DDM/CHS, содержащих буфер, для сравнения абсолютной растворимости и пикового объема человеческого TRPC3 в различных условиях по сравнению с управлением TRPM4.
Все различные моющие средства solubilized TRPC3 образцы показывают пиковые позиции около 11,9 миллилитров, которые, вероятно, слишком большой, потому что тетрамерная форма человека TRPC3 имеет меньший молекулярный вес, чем положительный контроль человека TRPM4. Затем тестируются два различных буфера solubilization и запуска, содержащие DDM/CHS и digitonin. Белок в буфере, содержащем дигитонин, дает наивысший пик в разумном положении по отношению к положительному контролю.
В то время как мелкомасштабная очистка с использованием 25 миллилитров клеток показывает несколько широких пиков, белок показывает особенности одного тетрамерного человеческого канала TRPC3 в 2D-классификации по отрицательному пятнам. Добавки затем проверяются на основе физиологического характера человека TRPC3. EDTA показывает значительное влияние на стабилизацию человеческого TRPC3 в нетронутом тетрамерного пикового положения и значительно увеличило количество частиц в крио-EM микрографе и уменьшило шум в фоновом режиме.
Качество окончательных результатов зависит от хорошего устранения неполадок профилей FSCC на HPLC. И по завершении всех этапов очищения быстро, в идеале в один день. Структурное определение, генерация антител и функциональные исследования, такие как, связывающие анализы или электрофизиология могут быть выполнены после этой процедуры.
Этот метод может и был адаптирован для изучения других ионных каналов и белковых семейств и производства очищенных белков для применения вне структурного определения. Следует принять надлежащие меры предосторожности для управления биоопасностью клеточной культуры, такие как работа в капюшоне из ламинарного потока, ношение защитной одежды и надлежащее удаление отходов.
