Questo protocollo ci ha permesso di risolvere la struttura del TRPC3 umano, membro di una famiglia importante, ma poco disostidita, di canali ionici. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'alta efficienza con cui può essere applicata per esprimere e purificare una varietà di proteine, sia per studi strutturali che funzionali. Questo metodo può fornire un efficiente sistema di espressione e purificazione delle proteine, da utilizzare nello studio della biochimica e della biofisica proteica e può essere applicato a un'ampia varietà di canali ionici e altre proteine di membrana.
In primo luogo, controllare l'espressione relativa del virus visualizzando la fluorescenza GFP del virus in un campione della coltura che produce virus. In un pallone di coltura Erlenmeyer inferiore sconcertato di dimensioni sufficienti, preparare un volume desiderabile di una coltura di sospensione cellulare di mammiferi HEK293, ad una concentrazione da 3,5 a 3,8 milioni di cellule per millilitro nel mezzo di espressione, integrato con FBS sterile all'1%. Aggiungere l'8% in volume della soluzione di stock di virus P2 preparata e incubare in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius e 135 RPM.
A 12-18 ore dopo l'infezione aggiungere 10 millimolare butirato di sodio, incubare a 30 gradi Celsius per la quantità di tempo necessaria per un'espressione proteica ottimale. Dopo questo, centrifuga a 2.880 volte la gravità per 20 minuti per raccogliere le cellule. Lavare e rimorsi le cellule in circa 100 millilitri di TBS per litro di cellule raccolte.
Centrifugare di nuovo a 2.880 volte la gravità per 20 minuti e raccogliere il pellet cellulare. Raccogliere anche piccoli raccolti di pellet di una cella millilitro in diversi punti di tempo e solubilizzare per due ore a quattro gradi Celsius con agitazione in presenza di diversi detergenti e / o additivi. Chiarire questi piccoli campioni solubilizzati a celle intere con ultracentrifugazione a 235.000 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi, eseguirli come campioni di 30 microliter su una colonna di cromatografia SEC, per determinare il momento migliore per l'espressione e le migliori condizioni di solubilizzazione. Scongelare il pellet in 100 millilitri di tampone per litro di cellule raccolte. Una volta scongelate le cellule, pipettare o mescolarle per garantire che la soluzione sia omogenea.
Lasciare solubilizzare le cellule a quattro gradi Celsius in un bicchiere immerso nel ghiaccio per due ore mentre vengono mescolate da una barra di agitazione. Quindi, rimuovere eventuali detriti cellulari per ultracentrifugazione a 235.000 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per un'ora. Eseguire un campione di 30 microliter del supernatante su una colonna SCC da parte di HPLC per verificare la quantità proteica e visualizzare la proteina bersaglio mediante l'uscita del segnale GFB.
Applicare il supernatante legato alla resina di affinità cobalto contenente la proteina solubilizzata su una colonna gravitazionale e raccogliere il flusso. Eseguire un campione di 30 microliter del flusso su una colonna SCC per verificare che la proteina si attacchi alla resina. Quindi, lavare la resina con 10 volumi di colonna di tampone.
Eseguire un campione di 30 microliter del lavaggio su una colonna SCC per verificare la perdita di proteine. Utilizzando tampone, elutare il TRPC3 umano legato alla resina. Eseguire un campione di 90 microliter dell'eluiante che è stato diluito da uno a 100 su una colonna SSC per verificare che la proteina sia stata eluita e per verificare la presenza di un segnale GFP nella posizione corrispondente alla dimensione della proteina bersaglio.
Aggiungere La trombina con un rapporto uno-20 molare e aggiungere 10 millimolari di EDTA al campione eluitato. Incubare a quattro gradi Celsius per tre ore. Successivamente, trasferire l'eluinte in un tubo filtrante centrifugo da 15 millilitri.
Ruotare il tubo a 2.800 volte la gravità e a quattro gradi Celsius in incrementi di cinque minuti per concentrare l'eluitante a 500 microlitri o meno. Pipettare la soluzione proteica su e giù tra i giri per rimorsi la proteina e prevenire la concentrazione estroppo. Caricare il concentrato su una colonna SSC nel buffer.
Eseguire cromatografia liquida proteica veloce e raccogliere 300 frazioni di microliter. Quindi, combinare le frazioni di picco che contengono il tetramero TRPC3 come visualizzato dal segnale di assorbanza UV. E concentrati di nuovo su una concentrazione finale di almeno cinque milligrammi per millilitro.
Il TRPC3 umano è solubilizzato in una varietà di detergenti con una concentrazione critica di micelle da 0,01 a 20 micromolari ed è stato eseguito in un tampone contenente DDM/CHS. Sebbene il DDM/CHS mostri la più alta solubilità del TRPC3 umano, la posizione di picco sembra troppo grande per essere l'umano tetramerico TRPC3. Dopo la solubilizzazione di cellule intere, i detriti di lisi cellulare vengono rimossi e la proteina solubilizzata viene caricata su una colonna SSC ed eseguita su HPLC in detersivo DDM/CHS contenente tampone, per confrontare la solubilità assoluta e il volume di picco del TRPC3 umano in condizioni diverse rispetto a un controllo TRPM4.
Tutti i diversi campioni di TRPC3 solubilizzati con detersivo mostrano posizioni di picco intorno agli 11,9 millilitri che è probabilmente troppo grande perché la forma tetramerica del TRPC3 umano ha un peso molecolare inferiore rispetto al controllo umano positivo TRPM4. Vengono quindi testati due diversi buffer di solubilizzazione ed esecuzione contenenti DDM/CHS e digitonina. La proteina eseguita in tampone contenente digitonina produce il picco più alto in una posizione ragionevole rispetto al controllo positivo.
Mentre una purificazione su piccola scala usando 25 millilitri di cellule mostra diversi picchi ampi, la proteina mostra le caratteristiche di un singolo canale TRPC3 umano tetramerico nella classificazione 2D per macchia negativa. Gli additivi vengono quindi schermati in base al carattere fisiologico del TRPC3 umano. L'EDTA mostra un notevole impatto sulla stabilizzazione del TRPC3 umano in una posizione di picco tetramerica intatta e aumenta significativamente il numero di particelle nella micrografia crio-EM e riduce il rumore sullo sfondo.
La qualità dei risultati finali dipende da una buona risoluzione dei problemi dei profili FSCC su HPLC. E completando tutti i passaggi di purificazione rapidamente, idealmente in un solo giorno. La determinazione strutturale, la generazione di anticorpi e gli studi funzionali come, saggi di legame o elettrofisiologia possono essere eseguiti dopo questa procedura.
Questa tecnica può ed è stata adattata per studiare altri canali ionici e famiglie proteiche e per produrre proteine purificate per applicazioni oltre la determinazione strutturale. Devono essere prese le precauzioni appropriate per gestire i rischi biologici di coltura cellulare, come lavorare in una cappa a flusso laminare, indossare indumenti protettivi e smaltire correttamente i rifiuti.
