لتحسين فهم ربط عامل النسخ- الحمض النووي، طورنا طريقة لقياس ثوابت الانفصام على نطاق واسع باستخدام قياسات النظائر على سبيل المثال. هذه التقنية تسمح بالحصول على منحنيات المعايرة الكاملة تلقائياً لتحديد ثابت الانفصام مع حساسية عالية. وهو يعمل في حل في التوازن، لديها متوسطة الإنتاجية ومجموعة ديناميكية كبيرة.
قمنا بتطبيق HiP-FA لصقل المشهد تقارب الربط من عوامل النسخ. ومع ذلك، يمكن تطبيق البروتوكول على أنواع أخرى من الأحداث الملزمة مثل البروتين البروتيني أو التفاعلات بين البروتين والمخدرات، على سبيل المثال. أنصح أولا لأداء المعايرات متعددة مع نفس الشركاء ملزمة للحصول على تقدير حول استنساخ القياسات.
إذا كان متوفراً، استخدم نظامًا تلقائيًا لتحسين إمكانية إعادة الاستخدام. إلى مائل oligomers الحمض النووي من الحمض النووي المرجعي، مزيج سبعة ميكرولترات من كل عشرة ملليمترات دي المسمى إلى الأمام وslalabeled حبلا عكسي في أنبوب واحد. بالنسبة للحمض النووي المنافس، اخلط 20 ميكرولترات من كل حبلا غير مُسمّي من 100 ملليلتر إلى بئرين من 96 لوحة PCR جيدة.
ثم، استخدم جهاز PCR قياسي لتسخين حلول الحمض النووي إلى 70 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. ثم، خفض إلى درجة حرارة الغرفة بمعدل 0.1 درجة مئوية في الثانية الواحدة. استخدام فرن الميكروويف لإذابة 0.5 غرام agarose في 100 ملليلتر ربط العازلة.
إضافة الماء المقطر مزدوجة لضبط حجم النهائي للتعويض عن التبخر ممكن. إعداد 10 ملليلتر الأسهم aliquots. لإعداد آبار المعايرة والمعايرة لطبقة 96 بئرًا ، قم بنقل اثنين من الأسهم الهلامية إلى شاكر حاضنة درجة مئوية 75.
لكل المعايرة جيدا، إضافة 1.4 نانوموليات من الحمض النووي المرجعي، بروتين عامل النسخ، في تركيز نهائي من 20-60 نانومول، 0.2 ملليمولار DTT، ومخزن ملزم ل240 ميكرولترات من هلام ذاب. تخلط جيدا عن طريق عكس وتهز الأنبوب. ثم، ببطء ماصة 200 ميكرولترات لكل بئر من هلام الحمض النووي المحتوية على في آبار المعايرة المعينة من لوحة 96 بئر.
لكل معايرة جيدا، إضافة 5 نانوموليس صبغة النيل الأزرق إلى 240 ميكرولترات من هلام الذائب. تجنب فقاعات الهواء، ماص ببطء 200 ميكرولترات من محلول هلام صبغية تحتوي على خمسة إلى ستة آبار من لوحة 96 جيدا. ضع الجل على سطح أفقي تمامًا وحضن لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة ، و10 دقائق أخرى عند 4 درجات مئوية.
استخدام قارئ لوحة متعددة جيدا للتحقق من تجانس مستويات ارتفاع هلام في آبار مختلفة من لوحة. لإعداد حل الحمض النووي المنافس ، والجمع أولا بين الحمض النووي المرجعي المسمى ، والبروتين ، وثلاثة أضعاف مركزة العازلة ملزمة. ثم، مزيج 20 ميكرولترات من الحل مع 40 ميكرولترات من كل من حلول الحمض النووي المنافس.
لكل معايرة جيدا، والجمع بين الكميات المناسبة من واحد من حلول الحمض النووي منافس محن ومخزن الربط المركز ثلاثية أضعاف التي تحتوي على 15 ميل 15 ميل النيل حل صبغة زرقاء. وأخيرا، إضافة 50 ميكرولترات من حلول المنافس مختلطة على رأس المواد الهلامية في وقت واحد ممكن. لبدء الحصول على صورة، ضع لوحة 96 جيدا على مرحلة المجهر.
ثم، تأخذ من الوقت سلسلة من الصور Z-المكدس من الآبار حتى غير ملزمة كاملة من البروتين من الحمض النووي المرجعي. إجراء المعايرة وفقا للمخطوطة. ثم استخدم برنامج HiP-FA لإنشاء منحنيات المعايرة لتسلسلات المنافس الفردية.
ثم، انقر فوق زر التصدير للحصول على ثابت الانفصام وتركيز البروتين النشط في كل عملية تحليل جيدة. اتخاذ عناية خاصة عند الأنابيب حلول هلام التي هي لزجة. يمكن أن يقلل القذف غير الدقيق من دقة تحديد ثوابت الانفصام.
في هذه الدراسة، يتم تطبيق طريقة HiP-FA لتحديد تفضيلات ربط الحمض النووي لعامل نسخ B-zipped. عملاق، من شبكة جينات تجزئة الذبابة. التشابه العالي لـ PWM للـ replicates التي تم إعدادها إما يدوياً أو باستخدام تقنيات التشغيل الآلي أظهرت قابلية تكرار عالية لأسلوب HiP-FA.
PWM's التي تم الحصول عليها بواسطة هذا الأسلوب وطرق أخرى متشابهة بشكل عام. ومع ذلك، يمكن رؤية انحرافات كبيرة في المواقف اثنين وسبعة من عزر الأساسية حيث الطفرات يمكن أن يؤدي إما إلى فقدان كامل للربط، أو ربط أقوى بكثير من القياسات السابقة. نحن نستخدم HiP-FA لتوليد تحسينات لربط عشرات من عامل النسخ ويظهر أن يحصل في النهاية على تنبؤ أفضل من البيانات.
ونحن نعتقد أن قياسها من دقة عالية يمكن أن تكون مفيدة جدا لفهم أفضل TF-DNA ملزمة لجميع النظام أو لجميع أنواع التفاعلات.
