転写因子-DNA結合の理解を深めるため、例えば異方性測定を用いて大規模に解離定数を測定する方法を開発しました。この技術により、自動的に完全な滴定曲線を取得し、解離定数を高感度で決定することができます。平衡時の溶液で働き、中程度のスループットと大きな動的範囲を有する。
HiP-FAを適用して、転写因子の結合アフィニティの景観を改良しました。しかし、このプロトコルは、例えばタンパク質とタンパク質相互作用やタンパク質薬物相互作用のような他の種類の結合事象に適用することができる。私は、測定の再現性に関する推定を得るために、最初に同じ結合パートナーと複数の滴定を実行することをお勧めします。
利用可能な場合は、より良い削減のために自動化されたシステムを使用してください。参照DNAのDNAオリゴマーをアニールするには、1つのチューブに10ミリモルの二量標識フォワードとラベルなしの逆鎖のそれぞれ7マイクロリットルを混合する。競合するDNAの場合、各100ミリモル未標識鎖の20マイクロリットルを96ウェルドPCRプレートの2つの井戸に混ぜます。
次に、標準的なPCR機を使用して、DNA溶液を摂氏70度まで3分間加熱します。その後、1秒あたり0.1°Cの速度で室温に下げます。電子レンジを使用して、100ミリリットルの結合バッファーで0.5グラムのアガロースを溶かします。
二重蒸留水を加えて、蒸発の可能性を補うために最終体積を調整します。10ミリリットルのストックアリコートを準備します。96ウェルプレートの滴定およびキャリブレーションウェルを準備するには、2つのゲルストックアリコートを75°Cインキュベーターシェーカーに移します。
各滴定ウェルについて、参照DNA、転写因子タンパク質の1.4ナノモルを、20〜60ナノモルの最終濃度で、0.2ミリモルDTT、および結合バッファーを溶融ゲルの240マイクロリットルに加える。チューブを反転・振るだけで充分に混ぜます。次いで、96ウェルプレートの指定された滴定ウェル内のDNA含有ゲルのウェル当たり200マイクロリットルをゆっくりとピペット化する。
キャリブレーションの各ウェルに対して、溶かしたゲルの240マイクロリットルに5ナノモルナイルブルー染料を加えます。気泡を避け、96ウェルプレートの5~6個のウェルに色素含有ゲル溶液のピペット200マイクロリットルをゆっくりとピペットする。ゲルを完全に水平な表面に置き、室温で10分間、摂氏4度でさらに10分間インキュベートします。
マルチウェルプレートリーダーを使用して、プレートの異なるウェルでゲル高さのレベルの均質性を確認します。競合遺伝子溶液を調製するために、まず標識された参照DNA、タンパク質、および3倍の濃縮結合バッファーを組み合わせます。次に、20マイクロリットルの溶液を、アニールされた競合のDNA溶液のそれぞれ40マイクロリットルと混合する。
キャリブレーションの各ウェルについて、アニールされた競合のDNA溶液の1つと15ミリモルナイルブルー色素溶液を含む3倍の濃縮結合バッファーの適切な量を組み合わせます。最後に、混合競合液を可能な限り同時にゲルの上に50マイクロリットル加えます。画像の取得を開始するには、96ウェルプレートを顕微鏡ステージに配置します。
次に、参照DNAからタンパク質の完全な結合が解除されるまで、ウェルのZスタック画像の時系列を取る。原稿に従って滴定アッセイを行う。その後、HiP-FA ソフトウェアを使用して、個々の競合シーケンスの滴定曲線を作成します。
次に、エクスポートボタンをクリックして、各滴定中の活性タンパク質の解離定数と濃度を良好に取得します。粘性のあるゲル溶液をピペットする際には、特に注意してください。不正確なピペット処理により、解離定数の決定精度が低下する可能性があります。
本研究では、B-zip型転写因子のDNA結合性の好みを決定するためにHiP-FA法を適用した。巨大、フライセグメンテーション遺伝子ネットワークから。手動で作成した複製用のPWMの高い類似性は、HiP-FA法の高い再現性を示しました。
この方法と他の方法によって得られるPWMは全体的に類似している。しかし、突然変異が完全な結合の喪失、または以前の測定よりもはるかに強い結合につながるコアモチーフの2および7位で有意な偏差が見られる。我々は、数十の転写因子の結合のための改良を生成するためにHiP-FAを使用し、最終的にデータのより良い予測を得ることを示している。
高精度の尺度は、全てのシステムやあらゆる種類の相互作用に対するTF-DNA結合をよりよく理解するのに非常に役立つと考えています。
