전사 인자-DNA 결합에 대한 이해를 향상시키기 위해, 우리는 예를 들어 이소성 측량 과 같은 대규모로 해리 상수를 측정하는 방법을 개발했습니다. 이 기술을 사용하면 자동으로 전체 적정 곡선을 획득하여 고감도로 해리 상수를 결정할 수 있습니다. 평형에서 솔루션으로 작동하며 중간 처리량및 큰 동적 범위를 가지고 있습니다.
우리는 전사 요인의 결합 친화성 풍경을 개선하기 위해 HiP-FA를 적용했습니다. 그러나, 프로토콜은 단백질 단백질 또는 단백질 약 상호 작용 같이 결합 사건의 그밖 종류에 적용될 수 있었습니다, 예를 들면. 먼저 동일한 바인딩 파트너와 여러 적정을 수행하여 측정의 재현성에 대한 추정을 얻는 것이 좋습니다.
사용 가능한 경우 자동화된 시스템을 사용하여 더 나은 중복성을 제공합니다. 참조 DNA의 DNA 올리고머를 멸폐하기 위해, 한 튜브에 앞뒤로 부착된 10밀리머 디 라벨과 라벨이 없는 역가닥의 7개의 마이크로리터를 섞는다. 경쟁사 DNA의 경우, 각 100 밀리머의 마이크로리터 20개를 96개의 잘 된 PCR 플레이트의 두 개의 우물에 섞는다.
그런 다음 표준 PCR 기계를 사용하여 DNA 용액을 섭씨 70도까지 3분 동안 가열합니다. 그런 다음 초당 섭씨 0.1도의 속도로 실온으로 줄입니다. 전자 레인지를 사용하여 100 밀리리터 바인딩 버퍼에 0.5 그램 아가로즈를 녹입니다.
이중 증류수를 추가하여 최종 체적을 조정하여 증발 가능성을 보정합니다. 10 밀리리터 스톡 알리쿼트 준비. 96웰 플레이트의 적정 및 교정 웰을 준비하려면 2개의 젤 스톡 알리코를 섭씨 75도의 인큐베이터 셰이커로 옮기습니다.
각 적정에 대해, 20-60 나노몰, 0.2 밀리몰러 DTT, 및 용융 젤의 240 마이크로리터에 결합 버퍼의 최종 농도에서 기준 DNA, 전사 인자 단백질의 1.4 나노몰을 추가합니다. 튜브를 반전하고 흔들어 서 완전히 섞습니다. 이어서, 96웰 플레이트의 지정된 적정 우물에서 DNA 함유 젤의 웰당 200 마이크로리터를 천천히 피펫한다.
각 교정에 대해 5나노몰드 나일 블루 염료를 녹인 젤의 240 마이크로리터에 추가합니다. 기포를 피하고, 96웰 플레이트의 5~6개의 우물에서 염료 함유 젤 용액의 천천히 파이펫 200 마이크로리터. 젤을 완벽하게 수평 표면에 놓고 실온에서 10 분 동안 배양하고 섭씨 4도에서 10 분 동안 배양하십시오.
멀티 웰 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트의 다른 우물에서 젤 높이 수준의 균일성을 확인하십시오. 경쟁사 DNA 용액을 준비하기 위해 먼저 표지된 참조 DNA, 단백질 및 3배 농축 결합 버퍼를 결합합니다. 그런 다음 솔루션의 마이크로리터 20개를 각 경쟁사 DNA 솔루션의 40마이크로리터와 혼합합니다.
각 교정에 대해, 15 밀리몰러 나일 블루 염료 용액을 포함하는 3배 농축 결합 버퍼 중 하나의 적당한 양을 결합한다. 마지막으로, 가능한 한 동시에 젤 위에 혼합 경쟁 솔루션의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 이미지 수집을 시작하려면 현미경 단계에 96 웰 플레이트를 배치합니다.
그런 다음, 참조 DNA에서 단백질의 완전한 결합이 완료 될 때까지 우물의 Z 스택 이미지의 시간 시리즈를. 원고에 따라 적정 분석 작업을 수행합니다. 그런 다음 HiP-FA 소프트웨어를 사용하여 개별 경쟁 시퀀스에 대한 적정 곡선을 만듭니다.
이어서, 수출 버튼을 클릭하여 각 적정에서 활성 단백질의 해리상수및 농도를 잘 얻습니다. 점성이 있는 젤 용액을 피펫팅할 때 특별한 주의를 기울이십시오. 부정확한 파이펫팅은 해리 상수의 측정을 위한 정확도를 낮출 수 있습니다.
이 연구에서는, HiP-FA 방법은 B-지퍼 전사 인자의 DNA 결합 선호도를 결정하기 위해 적용된다. 거대한, 비행 세분화 유전자 네트워크에서. 수동으로 또는 자동화 기술을 사용하여 제조된 복제에 대한 PWM의 높은 유사성은 HiP-FA 방법의 높은 재현성을 입증했습니다.
PWM은 이 방법 및 기타 방법에 의해 얻어진 것이 전반적으로 유사합니다. 그러나, 돌연변이가 결합의 완전한 손실, 또는 이전 측정 보다는 훨씬 더 강한 결합으로 이끌어 낼 수 있는 코어 모티프의 위치 2 그리고 7에서 중요한 편차를 볼 수 있습니다. 우리는 HiP-FA를 사용하여 수십 개의 전사 계수의 바인딩에 대한 개선점을 생성하며 결국 데이터를 더 잘 예측한다는 것을 보여줍니다.
우리는 높은 정확도의 측정이 모든 시스템 또는 모든 종류의 상호 작용에 대한 TF-DNA 결합을 더 잘 이해하는 데 매우 유용 할 수 있다고 믿습니다.
