כדי לשפר את ההבנה של עקדת גורם שעתוק-DNA, פיתחנו שיטה למדידת קבועי דיסוציאציה בקנה מידה גדול באמצעות למשל מדידות אניזוטרופיה. טכניקה זו מאפשרת קבלת עקומות טיטרציה מלאות באופן אוטומטי כדי לקבוע את קבוע הדיסוציאציה ברגישות גבוהה. זה עובד בפתרון ב שיווי משקל, יש תפוקה מתונה טווח דינמי גדול.
יישמו את HiP-FA כדי לחדד את נוף הזיקה המחייבת של גורמי שעתוק. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מיושם על סוגים אחרים של אירועים מחייבים כמו חלבון חלבון או חלבון-תגובות בין תרופתיות, למשל. אני ממליץ לבצע תחילה מספר טיטריות עם אותם שותפים מחייבים כדי לקבל הערכה לגבי השכפול של המדידות.
אם אפשרות זו זמינה, השתמש במערכת אוטומטית כדי להפוך אותה לזמינה עוד יותר. כדי להפוך את אוליגומרים DNA של ה-DNA התייחסות, לערבב שבעה microliters של כל עשרה מילימולר די שכותרתו קדימה גדיל הפוך ללא תווית בצינור אחד. עבור ה-DNA המתחרה, לערבב 20 microliters של כל גדיל 100 מילימולאר ללא חגורה לשתי בארות של צלחת PCR 96 היטב.
לאחר מכן, השתמש במכונת PCR סטנדרטית כדי לחמם את פתרונות הדנ"א ל-70 מעלות צלזיוס למשך שלוש הדקות. לאחר מכן, להפחית את טמפרטורת החדר בקצב של 0.1 מעלות צלזיוס לשנייה. השתמש בתנור מיקרוגל כדי להמיס 0.5 גרם אגרוז ב 100 מיליליטר מחייב חיץ.
הוסף מים מזוקקים כפולים כדי להתאים את הנפח הסופי כדי לפצות על אידוי אפשרי. הכינו 10 מיליליטר עליות במניות. כדי להכין את בארות טיטרציה וכיול של צלחת 96 באר, להעביר שני aliquots מלאי ג'ל שייקר אינקובטור 75 מעלות צלזיוס.
עבור כל titration היטב, להוסיף 1.4 ננומולים של DNA התייחסות, חלבון גורם שעתוק, בריכוז סופי של 20-60 nanomoles, 0.2 מילימולר DTT, ואת המאגר מחייב 240 microliters של ג'ל מומס. מערבבים היטב על ידי היפוך ורעידת הצינור. לאחר מכן, לאט פיפטה 200 microliters לכל באר של ג'ל המכיל DNA בארות טיטריון המיועד של צלחת 96 גם.
עבור כל כיול היטב, להוסיף 5 ננומולים נייל כחול צבע ל 240 microliters של ג'ל מומס. הימנעות בועות אוויר, לאט pipette 200 microliters של פתרון ג'ל המכיל צבע בחמש עד שש בארות של צלחת 96 היטב. מניחים את הג'ל על משטח אופקי לחלוטין ודגירה במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר, ועוד 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
השתמש בקורא צלחות רב היטב כדי לבדוק את ההומוגניות של רמות גובה הג'ל בארות שונות של הצלחת. כדי להכין את פתרון הדנ"א המתחרה, שלבו תחילה את הדנ"א של הייחוס המסווים, את החלבון ואת מאגר הכריכה המרוכז בשלושה קיפולים. לאחר מכן, מערבבים 20 מיקרוליטרים של הפתרון עם 40 מיקרוליטרים של כל אחד מפתרונות הדנ"א המתחרים.
עבור כל היטב כיול, לשלב את הכמויות המתאימות של אחד מפתרונות ה-DNA המתחרה annealed ואת חיץ כריכה מרוכזת פי שלושה המכיל 15 מילימולרי נימי כחול פתרון צבע. לבסוף, להוסיף 50 microliters של פתרונות מתחרים מעורבים על גבי הג'לים בו זמנית ככל האפשר. כדי להתחיל ברכישת תמונה, מקם את צלחת הבאר 96 על שלב המיקרוסקופ.
לאחר מכן, לקחת סדרת זמן של תמונות מחסנית Z של בארות עד ביטול מוחלט של החלבון מן ה-DNA התייחסות. בצע את בדיקת התיסוס על פי כתב היד. לאחר מכן השתמש בתוכנת HiP-FA כדי ליצור עקומות טיטריות עבור רצפי מתחרים בודדים.
לאחר מכן, לחץ על כפתור הייצוא כדי לקבל את קבוע הדיסוציאציה ואת הריכוז של החלבון הפעיל בכל טיטריאציה היטב. יש לדאוג במיוחד בעת צינורות פתרונות ג'ל כי הם צמיגים. צינורות לא מדויקים יכולים להוריד את הדיוק לקביעת קבועי הדיסוציאציה.
במחקר זה, שיטת HiP-FA מוחלת כדי לקבוע את ההעדפות מחייבות DNA של גורם שעתוק B-מכווצת. ענק, מרשת הגנים של פילוח הזבובים. הדמיון הגבוה של ה- PWM עבור שכפולים שהוכנו באופן ידני או באמצעות טכניקות אוטומציה הדגים את הרבייה הגבוהה של שיטת HiP-FA.
PWM של מתקבל על ידי שיטה זו ושיטות אחרות דומות בסך הכל. עם זאת, ניתן לראות סטיות משמעותיות בעמדות 2 ו-7 של מוטיב הליבה שבו מוטציות יכולות להוביל לאובדן מוחלט של כריכה, או קשירה חזקה בהרבה ממדידות קודמות. אנו משתמשים ב- HiP-FA כדי ליצור עידונים עבור כריכות של עשרות גורם שעתוק וזה מראה כי מקבל בסופו של דבר חיזוי טוב יותר של נתונים.
אנו מאמינים כי המדד שלה של דיוק גבוה יכול להיות מאוד שימושי כדי להבין טוב יותר TF-DNA מחייב עבור כל המערכת או עבור כל מיני אינטראקציות.
