Чтобы улучшить понимание связывания транскрипционных факторов и ДНК, мы разработали метод измерения диссоциательных констант в крупномасштабных масштабах с использованием, например, анисотропных измерений. Этот метод позволяет автоматически получать полные кривые титрования, чтобы определить константу диссоциации с высокой чувствительностью. Он работает в растворе на равновесии, имеет умеренную пропускную способность и большой динамический диапазон.
Мы применили HiP-FA для уточнения связывающего ландшафта сродства транскрипционных факторов. Тем не менее, протокол может быть применен к другим видам связывающих событий, таких как белково-белковые или белково-лекарственные взаимодействия, например. Я советую сначала выполнить несколько титраций с теми же обязательными партнерами, чтобы получить оценку воспроизводимости измерений.
При наличии, используйте автоматизированную систему для еще лучшего reducibility. Чтобы аннеалировать ДНК олигомеры эталонной ДНК, смешайте семь микролитров каждого десяти миллимолара ди-помеченных вперед и неотрещенной обратной нити в одной трубке. Для конкурента ДНК, смешать 20 микролитров каждого 100 миллимолярной неоцеливой нити в две скважины из 96 хорошо ПЦР пластины.
Затем используйте стандартную ПЦР-машину для нагрева растворов ДНК до 70 градусов по Цельсию в течение трех минут. Затем снизить до комнатной температуры в размере 0,1 градуса по Цельсию в секунду. Используйте микроволновую печь, чтобы расплавить 0,5 грамма агарозы в 100 миллилитров связывающего буфера.
Добавьте двойную дистиллированную воду, чтобы скорректировать конечный объем, чтобы компенсировать возможное испарение. Подготовь десять миллилитров акций aliquots. Для подготовки титрования и калибровки скважин 96 пластины скважины, передать два геля запас aliquots на 75 градусов по Цельсию инкубатор шейкер.
Для каждого титрования хорошо, добавить 1,4 наномолы эталонной ДНК, транскрипционный фактор белка, при конечной концентрации 20-60 наномолов, 0,2 миллимолярный DTT, и связывающий буфер до 240 микролитров расплавленного геля. Тщательно перемешайте и встряхнув трубку. Затем медленно пипетка 200 микролитров на колодец ДНК-содержащего геля в назначенных титрован скважин 96 пластины скважины.
Для каждой калибровки хорошо, добавить 5 nanomoles Нил синий краситель 240 микролитров расплавленного геля. Избегая пузырьков воздуха, медленно пипетки 200 микролитров красителя, содержащего гель раствор в пяти-шести скважин из 96 пластины скважины. Поместите гель на идеально горизонтальной поверхности и инкубировать в течение десяти минут при комнатной температуре, и еще 10 минут при температуре 4 градусов по Цельсию.
Используйте многофункциональный считыватель пластин, чтобы проверить однородность уровней высоты геля в разных колодцах пластины. Чтобы подготовить решение ДНК конкурента, сначала объедините помеченную эталонную ДНК, белок и трехкратный концентрированный связывающий буфер. Затем смешайте 20 микролитров раствора с 40 микролитров каждого из анналированных ДНК-решений конкурента.
Для каждой калибровки хорошо, объединить соответствующие количества одного из annealed конкурента ДНК решений и три раза концентрированный связывающий буфер, содержащий 15 миллимолялар Нил синий краситель раствор. Наконец, добавьте 50 микролитров смешанных решений конкурента поверх гелей как можно более одновременно. Чтобы начать получение изображения, поместите пластину 96 хорошо на сцене микроскопа.
Затем возьмите серию изображений скважин с стеками до полного несвежения белка из эталонной ДНК. Выполните анализ титрова в соответствии с рукописью. Затем используйте программное обеспечение HiP-FA для создания кривых титрованов для отдельных последовательностей конкурентов.
Затем нажмите кнопку экспорта, чтобы получить постоянную диссоциацию и концентрацию активного белка в каждой титрование хорошо. Особую осторожность при трубке гель решения, которые являются вязкими. Неточная трубоуборка может снизить точность определения констант диссоциации.
В этом исследовании, HiP-FA метод применяется для определения ДНК-связывающих предпочтений B-zipped транскрипции фактор. Гигант, из сети генов сегментации мух. Высокое сходство PWM для репликаций, которые были подготовлены вручную или с использованием методов автоматизации, продемонстрировало высокую воспроизводимость метода HiP-FA.
PWM, полученные с помощью этого метода и других методов, в целом похожи. Тем не менее, значительные отклонения можно увидеть на позициях два и семь основных мотивов, где мутации могут привести либо к полной потере связывания, или гораздо сильнее связывания, чем предыдущие измерения. Мы используем HiP-FA для создания уточнений для привязки десятков транскрипционных факторов, и это показывает, что получает в конце концов лучшее предсказание данных.
Мы считаем, что его мера высокой точности может быть очень полезна, чтобы лучше понять связывание TF-ДНК для всей системы или для всех видов взаимодействий.
