大肠杆菌无细胞蛋白合成: 一种强大、灵活和可访问的平台技术的协议

该协议简化并阐明了非专家实现自再蛋白合成的方法。改进对这些方法的访问将有助于将平台及其支持的广泛应用程序集去营销。与其他自再蛋白合成平台相比，该技术的主要优点是速度、成本效益和反应的易用性。

我们的平台可以支持许多应用，包括功能基因组学、子宫学测试、生物传感器、教育包，以及经过细微的修改、代谢工程和遗传密码扩展。虽然这项技术只需要基本的实验室培训，但新用户应该计划熟悉声波等技术，以便成功执行协议。要开始此过程，请准备文本协议中概述的所有培养基和培养大肠杆菌细胞。

将一升离心瓶放入冰水浴中。一旦培养物OD600达到3.0，将细胞培养物倒入冷藏瓶中。使用双光束平衡，将水添加到第二升离心瓶中，直到它的重量与第一个为离心机创建平衡的相同。

将离心机预冷却至4摄氏度后，将5000克和10摄氏度的瓶子离心10分钟，对细胞进行分粒。在此之后，慢慢倒掉并处置上经剂。将细胞颗粒放在冰上。

使用无菌铲将细胞颗粒从离心瓶中刮出，并转移到一个冷的50毫升锥形管中。加入30毫升的冷S30缓冲液，辅以两毫摩尔DTT，通过短暂冲旋在冰上进行短暂冲旋，重新暂停颗粒，直到颗粒完全重新暂停，没有块状。之后，再使用50毫米的圆锥管，用充满水的圆锥管作为平衡，在5000克和10摄氏度的温度下将样品离心10分钟。

倒掉并处置上一关。用20至25毫升的冷S30缓冲液重新填充颗粒。在5000克和10摄氏度下离心10分钟。

倒出并处置上一液。然后，加入30毫升的S30缓冲液，并使用前面描述的涡流重新暂停颗粒。设置三个预称冷的 50 毫升锥形管。

使用带无菌移液器的血清移液器填充剂，将十个 10 毫升颗粒悬浮液放入每个管中。根据需要在5000克和10摄氏度下使用适当的平衡将所有管子离心10分钟。在此之后，倒出并处置超级纳特人。

小心地用干净的组织擦拭每个管子的内侧和盖子，以去除接触缓冲液，同时确保避免接触颗粒。使用分析平衡，重新加压管并报告每个管的最终颗粒重量。首先，向每个颗粒添加一毫升冷S30缓冲液，每克细胞质量含有2毫摩尔DTT。

使用涡流重新暂停颗粒，如前所述。然后将每个重新增缩颗粒的1.4毫升转移到单独的1.5毫升微离心管中。将一根管子放入烧杯中的冰水浴中，并放置声波探针，使之不会接触管的底部或侧面。

将振幅设置为 50% 的管进行声波化 45 秒，然后进行 59 秒的休息。确保在关闭期间关闭和反转管子。声波化完成后，立即将一个摩尔DTT的4.5微升加入晶盐。

将管子倒置几次混合，然后放在冰上。重复此过程，对每管重新增殖细胞进行声波化和添加 DTT。将样品在18，000克和4摄氏度的离心10分钟。

在此之后，移液器每个上流液进入一个新的 1 . 5 毫升微离心管，留下一些上流液，以确保颗粒不扰。将上流液管放在孵化器的摇台上，在37摄氏度下孵育，在250 RPM下摇动60分钟。这是运行反应。

然后，将样品在10，000克和4摄氏度下离心10分钟。取出每个上流液，而不干扰颗粒将它们转移到新的管。创建许多 100 微升的分素用于存储的提取物。

首先，解冻溶液A、溶液B、DNA模板、BL21DE3提取物、T7RNA聚合酶和冰面上分子级水的等分。接下来，标记 CFPS 反应所需的微离心管量。通过移液或涡流混合每个试剂，然后将溶液添加到标记的反应管中，确保不涡流细胞提取物，而是反转管混合。

确保最终反应混合良好，并组合成每个管底部的单个 15 微升珠。在37摄氏度下4小时或30摄氏度过夜，不加热每次反应。首先，获得一个96井板，并加载48微升0.05摩尔海佩斯在pH 8到每个井所需的定量。

接下来，从培养箱中取出反应管。通过上下移液混合每个反应，将每种反应的两个微升转移到含有 HEPES 的井中。通过上下移液混合每个井。

加载和混合所有反应后，将板加载到荧光计中，并使用 485 纳米的激发波长度和 510 纳米的发射波长测量 SFGFP 端点荧光。使用以前生成的标准曲线确定从获得的荧光读数中超折叠 GFP 的浓度。本研究对基于声波的大肠杆菌提取物制剂进行了调查。

细胞颗粒和细胞提取物在负80摄氏度稳定至少一年。此外，细胞提取物可以经历至少五个冷冻解冻循环，而不会显著损失生产力。此协议中某些步骤可能会变化，而不会损害系统的整体生产力。

最值得注意的是，细胞可以在2.7至4.0光密度范围内在600纳米范围内采集，对细胞提取的生产力没有显著影响。然而，模板DNA质量是批次到批次变异性的来源，影响CFPS反应的体积产量。这可以通过通过 Midi 或 Maxiprep 净化 DNA，然后执行额外的 DNA 清理步骤来解决这个问题。

反应容器还影响 CFPS 反应的体积产量。表面积与体积比的增加，导致体积产量增加。为了优化CFPS反应的体积产量，并降低细胞提取物的批次对批次的变异性，应针对每种新的提取物制备进行镁滴定。

对于由每毫升总蛋白30毫克组成的细胞提取物，最佳镁浓度和萃取量，以尽量减少试剂使用，并最大限度地提高体积产量，分别是10毫摩尔和5微升。通过改变反应规模，用户可以采用从高通量筛选到目标蛋白的大规模表达等方法。该技术具有两个关键优势，一是筛选蛋白质产品速度更快，二是合成难以表达的蛋白质。

例如，蛋白质是细胞毒性或需要氧化条件，其功能。与任何实验室程序一样，所有试剂都应谨慎处理。此外，离心机应始终平衡，在声波过程中应使用耳朵保护。