Este protocolo simplifica y aclara los métodos para implementar la síntesis de auto-proteínas por parte de no expertos. El acceso mejorado a estos métodos ayudará a desmarketizar la plataforma y el amplio conjunto de aplicaciones que permite. Las principales ventajas de esta técnica son la velocidad, la rentabilidad y la facilidad de configuración de la reacción en comparación con otras plataformas de síntesis autoprotecica.
Nuestra plataforma puede permitir una serie de aplicaciones que incluyen genómica funcional, hithopertesting, biosensores, kits educativos, y con pequeñas modificaciones, ingeniería metabólica y expansión de código genético. Si bien esta técnica sólo requiere formación básica de laboratorio, los nuevos usuarios deben planear familiarizarse con técnicas como la sonicación para la ejecución exitosa del protocolo. Para comenzar este procedimiento prepare todas las células E.coli de medios y cultivos como se describe en el protocolo de texto.
Coloque una botella centrífuga de un litro en un baño de agua helada. Una vez que los cultivos OD600 alcanzan 3.0, verter el cultivo celular en la botella refrigerada. Usando un balance de doble haz, agregue agua a una segunda botella centrífuga de un litro hasta que pese lo mismo que la primera para crear una balanza para la centrífuga.
Después de pre-enfriar la centrífuga a cuatro grados Celsius, centrifugar las botellas a 5.000 g y a 10 grados Celsius durante 10 minutos para peletizar las células. Después de esto, vierta lentamente y deseche el sobrenadante. Coloque el pellet celular sobre hielo.
Usando una espátula estéril raspa el pellet celular de la botella centrífuga y transfiéralo a un tubo cónico frío de 50 mililitros. Añadir 30 mililitros de tampón S30 frío complementado con dos TDT milimolares y resuspend el pellet por vórtice en ráfagas cortas con períodos de descanso sobre hielo hasta que el pellet se resuspende completamente sin trozos. Después de esto, utilice otro tubo cónico de 50 milímetros lleno de agua como equilibrio para centrifugar la muestra a 5.000 g y 10 grados Celsius durante 10 minutos.
Vierta y deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet con 20 a 25 mililitros de tampón S30 frío. Centrifugar a 5.000 g y a 10 grados centígrados durante 10 minutos.
Vierta y deseche el sobrenadante. A continuación, agregue 30 mililitros de tampón S30 y resusppend el pellet utilizando un vórtice como se describió anteriormente. Establezca tres tubos cónicos prepesados, fríos y de 50 mililitros.
Utilizando un relleno de pipeta serológica con una pipeta estéril, aliquot diez 10 mililitros de suspensión de pellets en cada tubo. Centrifugar todos los tubos utilizando las balanzas adecuadas según sea necesario a 5.000 g y 10 grados Celsius durante 10 minutos. Después de esto, vierta y deseche los sobrenadantes.
Limpie cuidadosamente el interior de cada tubo y la tapa con un tejido limpio para extraer el tampón de acceso, mientras se asegura de evitar tocar el pellet. Usando un balance analítico, reequilibra los tubos e informe del peso final del pellet para cada tubo. Para comenzar, agregue un mililitro de tampón S30 frío con 2 TDT milimétricas por un gramo de masa celular a cada pellet.
Utilice un vórtice para resuspender los pellets como se describió anteriormente. A continuación, transfiera 1,4 mililitros de cada pellet resuspendido a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros separados. Coloque un tubo en un baño de agua helada en un vaso de precipitados y coloque la sonda sonicador de manera que no toque los fondos o los lados del tubo.
Sonicar el tubo con la amplitud establecida en 50% durante 45 segundos, seguido de 59 segundos de descanso. Asegúrese de cerrar e invertir los tubos durante los períodos de apagado. Inmediatamente después de que se complete la sonicación, agregue 4,5 microlitros de una TDT molar en el licato.
Invierta el tubo varias veces para mezclarlo y luego colóquelo sobre hielo. Repita este proceso, sonicando y añadiendo TDT para cada tubo de células resuspendidas. Centrifugar las muestras a 18.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Después de esto, pipetear cada sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, dejando algún sobrenadante para asegurar que el pellet no se moleste. Lleve los tubos de sobrenadante a la plataforma de agitación de una incubadora e incubarlos a 37 grados centígrados con temblores a 250 RPM durante 60 minutos. Esta es la reacción de eslorción.
Luego, centrifuga las muestras a 10.000 g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Retire cada sobrenadante sin alterar el pellet transfiriéndolos a nuevos tubos. Cree muchas 100 alícuotas de microlitros del extracto para su almacenamiento.
En primer lugar, descongelar la solución A, la solución B, la plantilla de ADN, el extracto BL21DE3, la ARN polimerasa T7 y una alícuota de agua de grado molecular sobre hielo. A continuación, etiquete la cantidad necesaria de tubos de microcentrífuga necesarios para la reacción CFPS. Mezclar cada reactivo por pipeteo o vórtice, luego añadir la solución al tubo de reacción etiquetado, asegurándose de no vórtice el extracto de la célula, sino invertir el tubo para mezclar.
Asegúrese de que la reacción final esté bien mezclada y combínela en un solo cordón de 15 microlitrotros en la parte inferior de cada tubo. Incubar cada reacción sin temblar a 37 grados centígrados durante cuatro horas, o a 30 grados centígrados durante la noche. Para empezar, obtener una placa de 96 pozos y cargar 48 microlitros de 0,05 HEPES molares a pH 8 en cada pozo necesario para la cuantificación.
A continuación, retire los tubos de reacción de la incubadora. Mezclar cada reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo y transferir dos microlitros de cada reacción a los pozos que contienen HEPES. Mezcle cada pozo pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Después de cargar y mezclar todas las reacciones, cargue la placa en un fluorómetro y mida los fluorescentes de punto final SFGFP utilizando una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 510 nanómetros. Utilice una curva estándar generada previamente para determinar la concentración de GFP supercarpeta a partir de la lectura de fluorescentes obtenidos. En este estudio, se investiga una preparación de extracto de E.coli basada en sonicación.
Pellets celulares y extracto de células son estables en 80 grados Celsius negativos durante al menos un año. Además, el extracto de célula puede sufrir al menos cinco ciclos de congelación-descongelación sin una pérdida significativa de productividad. Algunos pasos dentro de este protocolo pueden variar sin perjuicio de la productividad general del sistema.
Más notablemente, las células se pueden cosechar dentro del rango de 2.7 a 4.0 densidad óptica a 600 nanómetros sin un efecto significativo en la productividad del extracto celular. Sin embargo, la calidad del ADN de la plantilla es una fuente de variabilidad de lote a lote que afecta los rendimientos volumétricos de la reacción CFPS. Esto se resuelve purificando el ADN a través de un Midi o Maxiprep seguido de un paso adicional de limpieza de ADN.
El recipiente de reacción también afecta los rendimientos volumétricos de la reacción CFPS. Un aumento en la relación superficie-volumen, resulta en mayores rendimientos volumétricos. Para optimizar los rendimientos volumétricos de la reacción CFPS y reducir la variabilidad de lote a lote del extracto de célula, se debe realizar una valoración de magnesio para cada nueva preparación de extracto.
Para extractos celulares compuestos de 30 miligramos por mililitro de proteína total, la concentración óptima de magnesio y el volumen de extracto para minimizar el uso de reactivos y maximizar el rendimiento volumétrico es de 10 milimolar y cinco microlitros respectivamente. Al variar la escala de reacción, los usuarios pueden buscar métodos que van desde el cribado de alto rendimiento hasta expresiones a mayor escala de una proteína de destino. Esta técnica proporciona dos ventajas clave, primero examina los productos proteicos más rápidamente, y en segundo lugar, sintetiza proteínas difíciles de expresar.
Algunos ejemplos son las proteínas que son citotóxicas o requieren condiciones oxidantes para su función. Al igual que con cualquier procedimiento de laboratorio, todos los reactivos deben tratarse con precaución. Además, las centrífugas siempre deben estar equilibradas y se debe utilizar protección para los oídos durante la sonicación.
