Ce protocole simplifie et clarifie les méthodes de mise en œuvre de la synthèse auto-protéine par des non-experts. Un meilleur accès à ces méthodes aidera à démarketiser la plate-forme et le large éventail d’applications qu’elle permet. Les principaux avantages de cette technique sont la vitesse, la rentabilité et la facilité de réaction mises en place par rapport à d’autres plates-formes de synthèse auto-protéine.
Notre plate-forme peut permettre un certain nombre d’applications, y compris la génomique fonctionnelle, hythopertesting, biocapteurs, kits éducatifs, et avec des modifications mineures, le génie métabolique et l’expansion du code génétique. Bien que cette technique ne nécessite qu’une formation de laboratoire de base, les nouveaux utilisateurs devraient planifier de se familiariser avec des techniques comme la sonication pour l’exécution réussie du protocole. Pour commencer cette procédure préparer tous les médias et la culture des cellules E.coli comme décrit dans le protocole texte.
Placer une bouteille de centrifugeuse d’un litre dans un bain d’eau glacée. Une fois que les cultures OD600 atteint 3.0, versez la culture cellulaire dans la bouteille réfrigérée. À l’aide d’un double équilibre de faisceau, ajouter de l’eau à une deuxième bouteille centrifugeuse d’un litre jusqu’à ce qu’elle pèse la même chose que la première pour créer un équilibre pour la centrifugeuse.
Après avoir pré-refroidi la centrifugeuse à quatre degrés Celsius, centrifuger les bouteilles à 5000 g et à 10 degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter les cellules. Après cela, versez lentement et jetez le surnatant. Placez la pastille cellulaire sur la glace.
À l’aide d’une spatule stérile, racler la pastille de cellules de la bouteille de centrifugeuse et la transférer dans un tube conique froid de 50 millilitres. Ajouter 30 millilitres de tampon S30 froid complété par une TNT de deux millimolaires et résuspendre la pastille en tourbillonnant en rafales courtes avec des périodes de repos sur la glace jusqu’à ce que la pastille soit entièrement résuspendue sans morceaux. Après cela, utilisez un autre tube conique de 50 millimètres rempli d’eau comme un équilibre pour centrifuger l’échantillon à 5000 g et 10 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Verser et jeter le surnatant. Resuspendez la pastille avec 20 à 25 millilitres de tampon S30 froid. Centrifugeuse à 5000 g et à 10 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Verser et jeter le surnatant. Ensuite, ajoutez 30 millilitres de tampon S30 et réutilisez la pastille à l’aide d’un vortex tel qu’il a été décrit précédemment. Mettez en place trois tubes coniques pré-pesés, froids et de 50 millilitres.
À l’aide d’un remplisseur de pipette sérologique avec une pipette stérile, aliquot dix 10 millilitres de suspension à granulés dans chaque tube. Centrifugeuse tous les tubes en utilisant des équilibres appropriés au besoin à 5000 g et 10 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après cela, versez et jetez les surnatants.
Essuyez soigneusement l’intérieur de chaque tube et capuchon avec un tissu propre pour enlever le tampon d’accès, tout en vous assurant d’éviter de toucher la pastille. À l’aide d’un équilibre analytique, revérez les tubes et signalez le poids final des granulés pour chaque tube. Pour commencer, ajouter un millilitre de tampon S30 froid avec 2 millimolaires de TNT par gramme de masse cellulaire à chaque granulé.
Utilisez un vortex pour réutiliser les granulés comme décrit précédemment. Transférer ensuite 1,4 millilitres de chaque granulé résuspendé dans des tubes de microcentrifugeuses séparés de 1,5 millilitre. Placez un tube dans un bain d’eau glacée dans un bécher et placez la sonde sonicateur de telle sorte qu’elle ne touche pas les fonds ou les côtés du tube.
Sonicate le tube avec l’amplitude réglée à 50% pendant 45 secondes, suivie par 59 secondes de repos. S’assurer de fermer et d’inverser les tubes pendant les périodes de repos. Immédiatement après la fin de la sonication, ajouter 4,5 microlitres d’une TNT molaire dans le lysate.
Inverser le tube plusieurs fois pour le mélanger, puis le placer sur la glace. Répétez ce processus, en sonnant et en ajoutant de la TNT pour chaque tube de cellules résuspendées. Centrifugeuse les échantillons à 18 000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Après cela, pipette chaque supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, laissant un certain supernatant derrière pour s’assurer que la pastille n’est pas dérangée. Prenez les tubes de supernatant à la plate-forme tremblante d’un incubateur et incubez-les à 37 degrés Celsius avec des secousses à 250 RPM pendant 60 minutes. C’est la réaction de ruissellement.
Ensuite, centrifugez les échantillons à 10 000 g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez chaque supernatant sans déranger la pastille en les transférant dans de nouveaux tubes. Créer de nombreux aliquots de 100 microlitres de l’extrait pour le stockage.
Tout d’abord, la solution de dégel A, la solution B, le modèle d’ADN, l’extrait BL21DE3, la polymése d’ARN T7 et un aliquot d’eau de qualité moléculaire sur la glace. Ensuite, étiquetez la quantité nécessaire de tubes de microcentrifugeuse nécessaires à la réaction du SCF. Mélanger chaque reagent par pipetting ou vortexing, puis ajouter la solution au tube de réaction étiqueté, en s’assurant de ne pas vortex l’extrait de la cellule, mais plutôt inverser le tube pour mélanger.
Assurez-vous que la réaction finale est bien mélangée et combinez-la en une seule perle de 15 microlitres au bas de chaque tube. Incuber chaque réaction sans trembler à 37 degrés Celsius pendant quatre heures, ou à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Pour commencer, obtenir une plaque de puits de 96 et charger 48 microlitres de 0,05 MOLAIRE HEPES au pH 8 dans chaque puits nécessaire à la quantification.
Ensuite, retirez les tubes de réaction de l’incubateur. Mélanger chaque réaction en descendant de haut en bas et transférer deux microlitres de chaque réaction dans les puits contenant hepes. Mélangez chaque puits en faisant des tuyaux de haut en bas.
Après que toutes les réactions soient chargées et mélangées, chargez la plaque dans un fluoromètre et mesurez les fluorescents de point final SFGFP à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation de 485 nanomètres et d’une longueur d’onde d’émission de 510 nanomètres. Utilisez une courbe standard précédemment générée pour déterminer la concentration de GFP superfoldered à partir de la lecture fluorescente obtenue. Dans cette étude, une préparation à base d’extrait d’E.coli basée sur la sonication est étudiée.
Les granulés cellulaires et l’extrait cellulaire sont stables à 80 degrés Celsius négatifs pendant au moins un an. En outre, l’extrait cellulaire peut subir au moins cinq cycles de gel-dégel sans perte significative de productivité. Certaines étapes de ce protocole peuvent être modifiées sans nuire à la productivité globale du système.
Plus particulièrement, les cellules peuvent être récoltées dans la gamme de 2,7 à 4,0 densité optique à 600 nanomètres sans effet significatif sur la productivité de l’extrait cellulaire. Toutefois, la qualité de l’ADN modèle est une source de variabilité de lot à lot qui influe sur les rendements volumétriques de la réaction du SCF. Ceci est résolu en purifiant l’ADN via un Midi ou maxiprep suivi d’une étape supplémentaire de nettoyage de l’ADN.
Le navire de réaction a également une incidence sur les rendements volumétriques de la réaction du SCF. Une augmentation du rapport surface/volume se traduit par des rendements volumétriques plus élevés. Afin d’optimiser les rendements volumétriques de la réaction cfps et de réduire la variabilité de l’extrait cellulaire par lot, une titration de magnésium doit être effectuée pour chaque nouvelle préparation d’extrait.
Pour les extraits cellulaires composés de 30 milligrammes par millilitre de protéines totales, la concentration optimale de magnésium et le volume d’extrait pour minimiser l’utilisation des reagents et maximiser le rendement volumétrique est de 10 millimlaire et cinq microlitres respectivement. En variant l’échelle de réaction, les utilisateurs peuvent poursuivre des méthodes allant du criblage à haut débit aux expressions à plus grande échelle d’une protéine cible. Cette technique offre deux avantages clés, d’abord il filtre les produits protéiques plus rapidement, et deuxièmement, il synthétise difficile d’exprimer les protéines.
Par exemple, les protéines cytotoxiques ou qui nécessitent des conditions oxydantes pour leur fonction. Comme pour toute procédure de laboratoire, tous les reagents doivent être traités avec prudence. En outre, les centrifugeuses doivent toujours être équilibrées et la protection de l’oreille doit être utilisée pendant la sonication.
